Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版

第40卷第6期41卷第3期
第
2021
·332 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2020年6月年3月

gene，and the minimal active region of CHD4 gene promoter was determined. The effect of binding site on the transcription of CHD4
was analyzed by double luciferase reporter gene detection. Results：Flow cytometry showed that，compared with the control group，

CHD4 inhibited the apoptosis of Jurkat cells，the Jurkat cells transfected siRNA⁃CHD4 were significantly increased in the G0/G1
phase and decreased in the S phase（P < 0.01）. CCK⁃8 essay identified that CHD4 gene promoted the proliferation of Jurkat cells（P <
0.05）. Plasmids containing CHD4 gene candidate promoter and truncated sequence plasmids were successfully constructed. Compared
with empty vector，plasmids containing CHD4 gene candidate promoter sequences were significantly more active（P < 0.05）. The core
promoter of CHD4 gene located in 233 bp to 13 bp relative to transcription start site，which contained transcription factor binding sites
NF ⁃ κB and MZF1. NF ⁃ κB had a positive function to the CHD4 promoter activity. Conclusion：Our results suggested that CHD4
inhibited apoptosis and induced proliferation in Jurkat cells. The core promoter of CHD4 located in -233/-13 bp relative to TSS. NF⁃
κB bound to the core promoter of CHD4 in vivo and it had positive function to the promoter activity of CHD4.
［Key words］ T⁃cell acute lymphoblastic leukemia；apoptosis；chromatin helicase DNA binding protein 4（CHD4）；promote；trans⁃
cription factor
［J Nanjing Med Univ，2021，41（03）：331⁃338］

急性 T 细胞淋巴细胞白血病（T⁃cell acute lym⁃ 公司，美国）；限制性内切酶 KpnⅠ、BglⅡ、T4 DNA
phoblastic leukemia，T⁃ALL），是恶性程度较高的血 连接酶（Thermo Fisher 公司，德国）；rTaq DNA 聚合
液病 ，由于逐渐累积的基因突变破坏了正常的胸 酶、DNA 聚合酶 TaKaRa LA Taq and GC buffer、双荧
［1］
腺细胞发育过程，包括细胞生长、增殖、存活和分化 光素酶报告检测试剂盒、实时定量PCR试剂盒（TaKa⁃
的正常控制，导致 T 细胞祖细胞发生转化 。染色 Ra公司，日本）；5000 DNA标准参照物、2000 DNA标
［2］
质解旋酶 DNA 结合蛋白 4（recombinant chromodo⁃ 准参照物、核心启动子区NF⁃κB转录因子结合位点
main helicase DNA binding protein 4，CHD4），属于核 突变质粒 pGL⁃mNF⁃κB（北京擎科公司），NF⁃κB 表
小体重构和组蛋白脱乙酰酶复合体的重要成员之 达质粒 pcDNA3⁃NF⁃κB（吉凯基因）；质粒提取试剂
一 ，涉及许多致癌过程，与表观遗传密切相关，包 盒、切胶回收试剂盒（Omega 公司，美国），TRIzol、
［3］
括控制细胞周期进展，加速实体肿瘤转移，发动和 Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美国）；双荧光
TM
维持多种肿瘤抑制基因沉默等 ［4-6］ 。CHD4在T细胞 素酶报告分析系统（Promega 公司，美国）；CHD4、
发育过程中积极参与转录激活和抑制 ，CHD4可能 GAPDH 和 NF⁃κB 兔单克隆抗体（Abcam 公司，美
［7］
对于 T⁃ALL 的发生发展很重要，但是具体的影响以 国）；ECL 化学发光试剂盒（Biosharp 公司，美国），
及作用机制目前还不清楚。因此，本研究通过流式 PVDF（聚偏氟乙烯）膜（GE Healthcare 公司，美国）；
细胞技术检测和CCK⁃8检测探讨干扰CHD4基因表 EZ⁃Magna CHIP tm A试剂盒（Millipore公司，美国）。
达对 T⁃ALL 细胞增殖和凋亡的影响，通过构建人 1.2 方法
CHD4基因启动子重组质粒，进一步探讨CHD4基因 1.2.1 细胞培养
的转录调控，为了解T⁃ALL的发病机制提供新视角。 Jurkat 细胞用 RPMI 1640 培养基，HEK293T 细
胞用DMEM 培养基培养，两种培养基均含有10%的
1 材料和方法
胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及 1%青霉素
1.1 材料 （100 U/mL）⁃链霉素（100 mg/mL）溶液。两种细胞均
T⁃ALL 细胞（Jurkat）和人胚胎肾 T 细胞（HEK 置于具有一定湿度、37 ℃、5% CO2 的细胞培养箱
293T）均购于中国科学院上海细胞库。pGL3⁃Basic、 中。所有实验均在细胞生长对数期进行。
内参报告基因质粒pRL⁃TK由本实验室保存。基因 1.2.2 流式细胞技术
组 DNA 提取试剂盒、感受态大肠埃希菌（北京天根 流式细胞术检测 Jurkat 细胞凋亡百分率。经
公司）。DMEM 培养基、RPMI⁃1640 培养基、青霉素 qRT⁃PCR 分析确定 siRNA⁃CHD4 转染 Jurkat 细胞

和链霉素（Multicell公司，美国），进口胎牛血清（Sci⁃ 24 h 后敲低效率最高，所以转染24后收集细胞，PBS
en Cell公司，美国）；细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科 洗涤 3 次，加入 V⁃APC 和 7⁃AAD 各 5 μL，室温避光
生物公司），细胞周期检测试剂盒、CCK⁃8 检测试剂 15 min，使用流式细胞仪检测。细胞周期检测：采用

盒（南京福麦斯公司）；流式细胞仪（BD Biosciences 细胞周期检测试剂盒，细胞转染 siRNA⁃CHD4 24 h