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第42卷第3期        司林杰，李娜娜，陈艺南，等. 血浆外泌体miR⁃409⁃3p的异常表达与冠状动脉搭桥术围术期神经
                  2022年3月         认知障碍的相关性分析［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：340-344，351 ·341                ·


                        ［1］
                情绪状态 。冠状动脉搭桥术后，早期认知功能障                            1.2  方法
                碍发生率高，达 30%~60%，PND 严重影响患者术后                      1.2.1  神经心理学评估
                的生活质量 。目前，PND 的诊断主要基于患者症                              神经心理学测试主要用于评估注意力和执行
                          ［2］
                状的描述、精神状态的评估和临床行为的评估，                             能力、记忆和学习能力、视觉空间意识和语言流畅
                                            ［3］
                这些评估过程复杂且时间周期长 。虽然已经发现一                           性。该系列量表包括 MMSE、颜色轨迹测试（color
                些生物标志物与 PND 相关，如 S100 钙结合蛋白 B                     trail test，CTT）、数 字 跨 度 测 试（digital span test，
               （S100B）和神经元特异性烯醇化酶（neuron specific                 DST）、时钟绘图测试（clock drawing test，CDT）和语
                enolase，NSE），但与这些生物标志物相关的机制和                      言流利度测试（verbal fluency test，VFT）。这些测试
                               ［4］
                基因仍有待阐明 。在特定条件下释放的细胞外                             均由1位经验丰富且对手术过程和血浆样本结果不
                囊泡通过作用于外周和/或中枢受体，可能引发破                            知情的研究人员分别在手术前1 d和手术后7 d进行
                坏性级联反应，导致 PND 的发展 。外泌体大小为                         评估和记录。当至少有两个量表|Z|大于1.96时，则
                                             ［5］
                                                                                                          ［11］
                40~150 nm，是包含mRNA和非编码RNA的膜囊泡，                     认为发生了PND。具体方法参照之前的报道 。
                                                     ［6］
                从各种细胞中释放出来，参与细胞间通信 。Zhang                         1.2.2  患者数据收集
                  ［7］
                等 通过表达谱芯片发现了 68 个 lncRNA 和 115 个                      收集临床特征和围术期相关数据，包括患者的
                mRNA 在 PND 和非 PND 患者中存在差异表达。随                     年龄、身高、体重、性别、体重指数（body mass index，
                         ［8］
                后，Gao 等 研究表明 hsa_circRNA_001145、hsa_cir⁃          BMI）、教育年限和手术时间。在麻醉前 1 d 和手术
                cRNA_101138 和 hsa_circRNA_061570 在 PND 患者         后 7 d 收集血液样本（10 mL）。将所有样本收集在
                中呈高表达，可能参与了 PND 的发展。小 RNA                         抗凝管中，在 4 ℃ 条件下 300 g 离心 5 min，然后 1
               （microRNA，miRNA）是长度约为 22 个核苷酸的非                    200 g 和 4 ℃条件下离心 20 min，最后血浆保存在-
                编码单链 RNA 分子，通过转录后负调控基因表达                          80 ℃冰箱中直到进一步检测分析。
                来降低与生物学特性相关的蛋白质的表达，且许                             1.2.3  外泌体的提取和鉴定
                多研究已经证实 miRNA参与神经炎症并影响神经                              按照之前已发表文章中的方法，提取所有患
                系统疾病的发病机制 。多年来，本研究团队致力                            者血浆中的外泌体         ［12］ ，随后 PBS 缓冲液（Biological
                                   ［6］
                于 PND 领域的研究，并发表了多项研究成果 。前                         Industries公司，以色列）洗涤沉淀，5％戊二醛固定，
                                                        ［9］
                期，我们采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理               放入 2％磷钨酸溶液覆盖的碳包铜网格中 30 s。
                肥大细胞P815后通过miRNA 表达谱芯片分析发现                        透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）观
                外泌体 mmu⁃miR⁃409⁃3p 上调，并已在体内和体外                    察 外 泌 体 的 形 态 大 小 。 粒 径 分 析（nanoparticle
                实验中证明高表达的外泌体 miR⁃409⁃3p 促进神经                      tracking analysis，NTA）和ZetaView 8.04.02 软件测量
                炎症 。大量研究证实神经炎症在PND的发生和发                           外泌体大小和浓度。在28.7 ℃ pH 7.0的条件下使用
                    ［6］
                展中起关键作用        ［10］ ，然而，外泌体 miR⁃409⁃3p 与          110 nm 聚苯乙烯颗粒对 ZetaView 系统进行校准。
                PND的关系尚无报道。因此，本研究延续之前的结                           Western blot检测CD63、TSG101及Calnexin水平。含
                果，回归临床，从人群样本的角度分析血浆外泌体                            有10 μg/mL磷酸酶抑制剂和100 μg/mL PMSF（上海
                miR⁃409⁃3p与冠状动脉搭桥术PND的相关性。                        Beyotime公司）的RIPA 试剂（上海Beyotime公司）提
                                                                  取总蛋白，并用十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电
                1 对象和方法
                                                                  泳（SDS⁃PAGE）进行分离，随后转移至聚偏二氟乙
                1.1  对象                                           烯（PVDF）膜。1 h 后，分别用抗 CD63（ab134045，
                    选取2020年4月—2021年6月在南京医科大学                      Abcam 公司，英国）、抗 TSG101（ab30871，Abcam 公
                第一附属医院接受冠状动脉搭桥手术的患者，并收                            司，英国）、抗Calnexin（2679S，Cell Signaling Technology
                集所有患者的血浆样本。排除标准：先前存在神                             公司，美国）在 4 ℃冰箱卵鸟育过夜。次日，PBS 洗涤

                经系统疾病，包括简易智能量表（mini⁃mental state                  3 次，每次 5 min，分别与相应的二抗孵育 2 h。采用
                examination，MMSE）评分 < 24 分；服用抗抑郁药或                增强化学发光（ECL）进行样本检测分析。
                抗焦虑药病史；神经心理学评估困难。本研究经南                            1.2.4  实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR，
                京医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，并                            qRT⁃PCR）
                获得了每位患者的书面知情同意书。                                      分 别 采 用 exoRNeasy Midi 试 剂 盒（Qiagen 公
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