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第42卷第5期 郑礼平，王玉婷，倪罗番，等. 兼具抗氧化和γ⁃氨基丁酸增强活性的多功能抗脑卒中化合物［J］.
2022年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（05）：644-649 ·647 ·

50%。 H NMR（400 MHz，CDCl3 ）δ：7.52（d，J=2.8 Hz， 制性反应。记录过程中持续观察串联阻抗，以防
1
2H，arom），7.41（d，J=2.8 Hz，2H，arom），4.74（s，1H， 止细胞破膜后的重封接，与本底值差异大于 20%
OH），3.4（s，2H，CH2 ），2.27（s，3H，CH3 ），2.19（s，3H， 者弃用。
CH3 ），1.42（s，9H，C（CH3 ） 3 ）. MS（ESI，m/z）：261.2［M⁃ 1.3 统计学方法
H］。 应用 Excel 分析软件计算测定结果的标准差，
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1.2.2 生物活性测试 实验数据采用均数±标准差（x ± s）表示，用t 检验分
1.2.2.1 DPPH自由基清除实验 析组间差异。用 Grubbs 检验法对测定数据的有效
DPPH浓度为1.2 mmol/L，样品液配制成各个浓 性进行分析，以显著性水平α=0.05作为评价数据有
度梯度：0、0.10、0.15、0.20、0.30、0.60、1.20 mmol/L。 效性的标准。
在一块 96 孔板中加入 DPPH 溶液 500 μL，各个浓
2 结 果
度的样品液 500 μL，每个浓度的样品溶液设3个平
行孔。室温避光孵育 30 min，使用酶标仪测定各孔 从 2，6⁃二异丙基苯酚和 2⁃甲基⁃6⁃叔丁基苯酚
在 517 nm 的吸光度。0 mmol/L 样品液的吸光度为 出发，经 6 步反应，成功合成了 2 个依达拉奉类似

A0，其余浓度的吸光度为 A，按公式：清除率=（A0- 物，见图2。DPPH自由基清除实验表明，依达拉奉、
A）/ A0×100%计算样品各个浓度的清除率。使用 6a、6b 的 EC50分别为（0.326±0.120）mmol/L、（0.158±

Origin 8.5.1制作样品的清除率曲线，拟合方程Logis⁃ 0.200）mmol /L和（0.183±0.150）mmol/L（图2）。6a和
tic方程，并得到样品的EC50值。 6b显示了比依达拉奉更强的自由基清除活性。
1.2.2.2 短暂性脑缺血模型
125 依达拉奉
实验方案参照 Zhou 等 ［11］ 的短暂性脑缺血模 6a
型。实验分假手术组、手术组、依达拉奉对照组、化 （ % ） 100 6b
合物6a、6b治疗组，每组动物数15。简而言之，水合 75
氯醛（350 mg/kg，ip）麻醉 SD 大鼠，通过颈外动脉残 DPPH清除率 50
端将 4/0 外科尼龙单丝带圆形尖端引入左颈内动
脉，在颈动脉分叉处前进 20~21 mm，直到感觉到轻 25
微的阻力。此时，腔内细丝阻塞了大脑中动脉、颈 0
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50
内动脉、大脑前动脉和大脑后动脉的所有血源。 浓度（mmol/L）
在整个过程中，体温保持在（37.0±0.5）℃。将栓线 图2 依达拉奉、6a和6b的DPPH自由基清除活性
留在原位 120 min，然后取出再灌注。取出栓线 Figure 2 DPPH free radical scavenging activity of edara⁃
后，立即通过尾静脉给药（药物处方：5% DMSO、 vone，6a and 6b
18%丙二醇、0.1%亚硫酸氢钠、10% HS⁃15、62%生 体内的脑卒中模型显示，等摩尔量的化合物6a
理盐水）。在假手术动物中，闭塞细丝仅插入颈动 和 6b 显示了比对照药物依达拉奉更优的神经保护
脉分叉处上方7 mm处。在MCAO后2 h进行梗死体 效果（图 3）。手术组的梗死面积百分比是（36.0±
积测量。快速取出大脑并在-20 ℃下冷冻 5 min。 3.1）%（n=15），依达拉奉阳性对照组（6 mg/kg）、化合

制成 1~2 mm 冠状切片，切片浸入 2% TTC，37 ℃ 物 6a（9.2 mg/kg）、化合物 6b（9.44 mg/kg）治疗组的
4 h。梗死体积表示为梗死半球中冠状切面的百分 梗死面积百分比分别降为（13.5±1.2）%（n=15）、
比面积。 （10±1.0）%（n=15）、（7.3±0.34）%（n=15）。经t检验，
1.2.2.3 GABA增强作用及直接激动作用实验 化合物6a和6b的神经保护作用显著优于依达拉奉
采用膜片钳电压钳全细胞记录模式，开始记录 对照组（P < 0.01）。
之前，小鼠皮层神经元至少观察5 min，保证细胞处于 对神经保护作用较好的化合物 6b 进行了 GA⁃
较为稳定状态。灌流液中加入Na 通道阻断剂（TTX， BA 活性的验证（图 4）。化合物 6b 在 5 mmol/L 时对
+
1 μmol/L）、AMPAR 受体阻断剂（CNQX，10 μmol/L） GABA 没有增强活性，20~40 mmol/L 区间体现显著
和 NMDA 受体阻断剂（APV，50 mmol/L），钳制细 的 GABA 增强活性，且显示剂量依赖性（图 4A~C）。
胞在-70 mV 记录自发性抑制性突触后电流，根据 6b在高剂量下（500 mmol/L）显示对GABA受体的直
实验设计，分别灌流GABA或药物，观察其诱发的抑 接激动活性（图4D）。