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第42卷第6期       王红玉，顾     浩，葛 爱，等. 蛋白酶激活受体2经ROS信号调控支气管上皮间充质表型转化［J］.
                  2022年6月                   南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：790-795，829                     ·791 ·


               （extracellular matrix，ECM）沉积等 ［1-2］ 。随着EMT 机       tin，α⁃SMA）（ab5694）、N⁃cadherin（ab76011）、E⁃cad⁃
                制的不断探索，其与气道疾病、尤其与哮喘的相关                            herin（ab40772）特异性抗体（Abcam公司，英国）。抗
                性已倍受关注。新近研究证实，EMT在上皮异常修                           甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate
                复、纤维生成等过程中扮演了重要角色                 ［3-4］ 。人支气      dehydrogenase，GAPDH）特异性抗体（2118，CST 公
                管上皮细胞（human bronchial epithelial cell，HBE）作       司，美国）。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗
                为机体接触外界的第一道防线，应激后发生 EMT，                          体（sc⁃2004，Santa Cruz公司，美国）。
                同时产生多种促纤维化因子如转化生长因子⁃β                             1.2  方法
               （transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）等加速 EMT 进      1.2.1 细胞培养
                  ［5］
                程 。EMT 时，HBE 历经细胞间连接丢失等一系列                            人支气管上皮细胞系 16HBE 购自北京癌症研
                改变，启动整个气道重塑过程。然而，哪些因素参                            究所，培养于 RPMI 1640 培养基（Invitrogen Gibco公
                与调控EMT及其具体机制目前仍不明确。                               司，美国）、1%青霉素/链霉素（Invitrogen Gibco 公

                    蛋白酶激活受体 2（protease⁃activated receptor         司 ，美 国）及 10% 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，
                2，PAR2）作为独特的 PAR 家族成员，在呼吸系统                       FBS，Invitrogen Gibco 公司，美国）配制的完全培养
               （如支气管上皮、成纤维、内皮细胞等）广泛表达 ，                           基，置于37 ℃、5% CO2条件的细胞培养箱孵育，每隔
                                                           ［6］
                且参与多种呼吸系统疾病体内稳态的调节。作为                             2~3 d 更换培养基，直至细胞密度达 80%后，0.5%胰
                细胞表面的“传感器”，PAR2 主要介导细胞对胞外                         酶（Invitrogen Gibco公司，美国）消化、传代。
                丝氨酸蛋白酶的应答。其天然配体——类胰蛋白                             1.2.2 划痕实验
                酶（是机体内 PAR2 的天然激动剂，主要源于肥大                             划痕实验检测 16HBE 修复迁移功能。16HBE
                细胞，被认为是哮喘中的一种重要炎症介质），通                            接种于6孔板，培养24 h后以无血清培养基饥饿6~
                                            ［7］
                过裂解 PAR2 胞外段、激活受体 ，在哮喘、COPD、                      8 h；使用 200 μL 无菌移液枪头尖端在细胞上进行
                肺纤维化等慢性呼吸系统疾病中对成纤维细胞                              一次笔直划痕，PBS清洗漂浮的细胞；每孔加入含不
                的增殖具有促进作用            ［8］ 。急性肺损伤中，激活               同浓度类胰蛋白酶、NAC、TGF⁃β的无血清培养基，
                PAR2 不仅可引起成纤维细胞增殖 ，还可导致内                          立即显微镜拍照；培养箱孵育 24 h 后，再次记录划
                                               ［9］
                皮屏障功能障碍、血管通透性增加                  ［10］ ，可见肺组       痕区域。使用Image J软件计算迁移平均距离，重复
                织中 PAR2 对多种细胞的功能具有调控作用。然                          3次实验进行统计学分析。
                而，PAR2 对气道重要结构细胞 HBE 的功能、尤其                       1.2.3 迁移实验
                是其 EMT 表型转化过程是否存在影响，迄今尚未                              Transwell 小室迁移实验检测 16HBE 迁移功
                见报道。                                              能。完全培养基中培养16HBE至密度80%后，无血
                    机体多种病理生理过程中，活性氧（reactive ox⁃                  清培养基饥饿；细胞计数后以 100 μL 细胞悬液
                ygen species，ROS）是一类重要的信号分子          ［11］ 。研究    （2.0×10 个/孔）接种于 Transwell（Corning 公司，美
                                                                         4
                发现，ROS 生成与 PAR2 活化密切相关             ［12］ 。本研究      国）上室，置于24孔板中；加入含不同浓度的类胰蛋
                通过体外培养 HBE、建立 TGF⁃β诱导的 EMT 模型，                    白酶、NAC、TGF⁃β的完全培养基于下室，细胞培养
                着重观察PAR2活化对HBE 细胞EMT 的影响、并阐                       箱中孵育 24 h；弃培养基、PBS 清洗，多聚甲醛固定
                明ROS信号在该过程中的作用。                                   30 min 后，棉签擦拭小室细胞，结晶紫孵育 5 min；
                                                                  PBS清洗3次后，显微镜拍照。随机取4个不同视野
                1  材料和方法
                                                                  计数，并行统计学分析。
                1.1  材料                                           1.2.4 蛋白质免疫印迹实验
                    类胰蛋白酶（T7063）、ROS 检测试剂盒（reactive                   蛋白质免疫印迹实验检测16HBE 中α⁃SMA、E⁃
                oxygen species，DCFH⁃DA）（MAK143，Sigma⁃Aldrich      cadherin、N⁃cadherin 蛋白表达量。用不同浓度类
                公司，美国）。ROS清除剂N⁃乙酰半胱氨酸（N⁃acety                     胰蛋白酶刺激 16HBE 48 h 后收集细胞、PBS 洗涤
                ⁃1⁃cysteine，NAC）（616⁃91⁃1，中国国药集团）。PAR2            2 次，200 μL RIPA 冰上裂解 15 min；收集裂解物，
                抑制剂 FSLLRY⁃NH2（FS）（C7865BL120⁃1，南京金               14 000 r/min 离心 20 min，十二烷基硫酸钠（sodium
                斯瑞公司）。TGF⁃β1（7754⁃BH，R&D system 公司，               dodecyl sulfate，SDS）蛋白变性；制胶上样，80~120 V
                美国）。抗α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle ac⁃                恒压电泳，300 mA 恒流PVDF 转膜；Tween 20的Tris
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