Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
·792 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月
洗涤缓冲液(TBST)配制 5%脱脂奶粉溶液,37 ℃封 1.3 统计学方法
闭1 h;加入抗α⁃SMA(1∶100)、E⁃cadherin(1∶1 000)、 使用 Graphpad 6.0 和 SPSS 20 统计软件进行分
N⁃cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗体 4 ℃孵 析处理,计量资料以均值±标准差(x ± s)表示,单因
育过夜;TBST 洗涤后,与辣根过氧化物酶标记的山 素方差分析比较多组间差异。P<0.05 为差异有统
羊抗兔 IgG 抗体孵育;ECL 化学发光液(Thermo 公 计学意义。
司,美国)曝光,并用 Bio⁃Rad Gel Doc/Chemi Doc 成
2 结 果
像系统及Quantity One软件进行分析。
1.2.5 ROS测定 2.1 类胰蛋白酶促HBE细胞修复与迁移
DCFH⁃DA 探针检测 16HBE 胞内 ROS。细胞内 上皮细胞发生 EMT 时,修复、迁移功能增强。
ROS可与DCFH反应生成DCF的荧光产物。本研究 本研究结果显示,对照组HBE细胞形态呈典型的鹅
中,10 mmol/L DCFH⁃DA溶于无血清培养基中,稀释 卵石样特征,修复、迁移功能较弱(图 1);然而给予
1 000 倍得到 10 μmol/L 工作液;将密度达 80%的 不同浓度(1、10、50、100 pmol/L)类胰蛋白酶作用
16HBE 接种于 6 孔板中,实验组试剂处理 6 h;37 ℃ 后,细胞呈现纺锤形,修复、迁移功能明显增强(图
DCFH⁃DA探针避光作用30 min,PBS洗涤2次,激光 1)。当浓度≥50 pmol/L 时,类胰蛋白酶可显著上
扫描共聚焦显微镜(LSM 5 LIVE,Zeiss 公司,德国) 调细胞的修复、迁移能力(P < 0.05,图 1);浓度达
调节为 FL1 Log 通道,525 nm 波长,观察细胞并拍 100 pmol/L 时,细胞修复、迁移能力与TGF⁃β阳性对
照。随机取4个不同视野行统计学分析。 照组(10 ng/mL)相近(图1)。
A 对照组 Tr 1 pmol/L组 Tr 10 pmol/L组 Tr 50 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组 200 *
( % ) 150 * *
划痕愈合率 100
50
0
对照组
Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
TGF⁃β 10 ng/mL组
Tr 50 pmol/L组
Tr 10 pmol/L组
( % ) 800 * *
B 对照组 Tr 1 pmol/L组 Tr 10 pmol/L组 Tr 50 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组
迁移细胞相对比例 400 *
600
200
0
Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
Tr 50 pmol/L组
TGF⁃β 10 ng/mL组
对照组
Tr 10 pmol/L组
A:划痕实验图及半定量分析图(标尺:50 μm);B:Transwell迁移实验图及半定量分析图(标尺:50 μm)。Tr:类胰蛋白酶;与对照组相比,
P < 0.05;n=3。
*
图1 类胰蛋白酶促16HBE 细胞修复与迁移
Figure 1 Tryptase promoted the repair and migration of 16HBE cells
2.2 类胰蛋白酶下调HBE细胞E⁃cadherin、上调N⁃ (E⁃cadherin)表达降低(P < 0.05,图 2)。故选择
cadherin及α⁃SMA蛋白表达 100 pmol/L 浓度进行后续研究。
EMT 过程中,往往伴随上皮、间充质细胞特征 2.3 类胰蛋白酶上调HBE细胞ROS的水平
标志物水平的变化。蛋白印迹结果显示,不同浓 既往肺纤维化研究提示,ROS 是疾病进展的重
度类胰蛋白酶处理 16HBE 后,间充质细胞标志物 要信号,胞内ROS水平与EMT诱导密切相关。本研
(N⁃cadherin 及α⁃SMA)表达上调,上皮细胞标志物 究采用DCFH⁃DA 探针结合荧光显微镜观察ROS水