Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第6期
·792 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月

洗涤缓冲液（TBST）配制 5%脱脂奶粉溶液，37 ℃封 1.3 统计学方法
闭1 h；加入抗α⁃SMA（1∶100）、E⁃cadherin（1∶1 000）、 使用 Graphpad 6.0 和 SPSS 20 统计软件进行分
N⁃cadherin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体 4 ℃孵 析处理，计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，单因
育过夜；TBST 洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的山 素方差分析比较多组间差异。P＜0.05 为差异有统
羊抗兔 IgG 抗体孵育；ECL 化学发光液（Thermo 公 计学意义。
司，美国）曝光，并用 Bio⁃Rad Gel Doc/Chemi Doc 成
2 结 果
像系统及Quantity One软件进行分析。
1.2.5 ROS测定 2.1 类胰蛋白酶促HBE细胞修复与迁移
DCFH⁃DA 探针检测 16HBE 胞内 ROS。细胞内 上皮细胞发生 EMT 时，修复、迁移功能增强。
ROS可与DCFH反应生成DCF的荧光产物。本研究 本研究结果显示，对照组HBE细胞形态呈典型的鹅
中，10 mmol/L DCFH⁃DA溶于无血清培养基中，稀释 卵石样特征，修复、迁移功能较弱（图 1）；然而给予
1 000 倍得到 10 μmol/L 工作液；将密度达 80%的 不同浓度（1、10、50、100 pmol/L）类胰蛋白酶作用

16HBE 接种于 6 孔板中，实验组试剂处理 6 h；37 ℃ 后，细胞呈现纺锤形，修复、迁移功能明显增强（图
DCFH⁃DA探针避光作用30 min，PBS洗涤2次，激光 1）。当浓度≥50 pmol/L 时，类胰蛋白酶可显著上
扫描共聚焦显微镜（LSM 5 LIVE，Zeiss 公司，德国） 调细胞的修复、迁移能力（P < 0.05，图 1）；浓度达
调节为 FL1 Log 通道，525 nm 波长，观察细胞并拍 100 pmol/L 时，细胞修复、迁移能力与TGF⁃β阳性对
照。随机取4个不同视野行统计学分析。 照组（10 ng/mL）相近（图1）。

A 对照组 Tr 1 pmol/L组 Tr 10 pmol/L组 Tr 50 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组 200 *
（ % ） 150 * *
划痕愈合率 100

50
0
对照组
Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
TGF⁃β 10 ng/mL组
Tr 50 pmol/L组
Tr 10 pmol/L组
（ % ） 800 * *
B 对照组 Tr 1 pmol/L组 Tr 10 pmol/L组 Tr 50 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组
迁移细胞相对比例 400 *
600

200
0
Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
Tr 50 pmol/L组
TGF⁃β 10 ng/mL组
对照组
Tr 10 pmol/L组
A：划痕实验图及半定量分析图（标尺：50 μm）；B：Transwell迁移实验图及半定量分析图（标尺：50 μm）。Tr：类胰蛋白酶；与对照组相比，
P < 0.05；n=3。
*
图1 类胰蛋白酶促16HBE 细胞修复与迁移
Figure 1 Tryptase promoted the repair and migration of 16HBE cells

2.2 类胰蛋白酶下调HBE细胞E⁃cadherin、上调N⁃ （E⁃cadherin）表达降低（P < 0.05，图 2）。故选择
cadherin及α⁃SMA蛋白表达 100 pmol/L 浓度进行后续研究。
EMT 过程中，往往伴随上皮、间充质细胞特征 2.3 类胰蛋白酶上调HBE细胞ROS的水平
标志物水平的变化。蛋白印迹结果显示，不同浓 既往肺纤维化研究提示，ROS 是疾病进展的重
度类胰蛋白酶处理 16HBE 后，间充质细胞标志物 要信号，胞内ROS水平与EMT诱导密切相关。本研
（N⁃cadherin 及α⁃SMA）表达上调，上皮细胞标志物 究采用DCFH⁃DA 探针结合荧光显微镜观察ROS水