Page 40 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
               ·792 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年6月


              洗涤缓冲液(TBST)配制 5%脱脂奶粉溶液,37 ℃封                      1.3  统计学方法
              闭1 h;加入抗α⁃SMA(1∶100)、E⁃cadherin(1∶1 000)、              使用 Graphpad 6.0 和 SPSS 20 统计软件进行分
              N⁃cadherin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗体 4 ℃孵         析处理,计量资料以均值±标准差(x ± s)表示,单因
              育过夜;TBST 洗涤后,与辣根过氧化物酶标记的山                         素方差分析比较多组间差异。P<0.05 为差异有统
              羊抗兔 IgG 抗体孵育;ECL 化学发光液(Thermo 公                   计学意义。
              司,美国)曝光,并用 Bio⁃Rad Gel Doc/Chemi Doc 成
                                                                2  结 果
              像系统及Quantity One软件进行分析。
              1.2.5 ROS测定                                       2.1  类胰蛋白酶促HBE细胞修复与迁移
                  DCFH⁃DA 探针检测 16HBE 胞内 ROS。细胞内                      上皮细胞发生 EMT 时,修复、迁移功能增强。
              ROS可与DCFH反应生成DCF的荧光产物。本研究                         本研究结果显示,对照组HBE细胞形态呈典型的鹅
              中,10 mmol/L DCFH⁃DA溶于无血清培养基中,稀释                   卵石样特征,修复、迁移功能较弱(图 1);然而给予
              1 000 倍得到 10 μmol/L 工作液;将密度达 80%的                 不同浓度(1、10、50、100 pmol/L)类胰蛋白酶作用

              16HBE 接种于 6 孔板中,实验组试剂处理 6 h;37 ℃                  后,细胞呈现纺锤形,修复、迁移功能明显增强(图
              DCFH⁃DA探针避光作用30 min,PBS洗涤2次,激光                    1)。当浓度≥50 pmol/L 时,类胰蛋白酶可显著上
              扫描共聚焦显微镜(LSM 5 LIVE,Zeiss 公司,德国)                  调细胞的修复、迁移能力(P < 0.05,图 1);浓度达
              调节为 FL1 Log 通道,525 nm 波长,观察细胞并拍                   100 pmol/L 时,细胞修复、迁移能力与TGF⁃β阳性对
              照。随机取4个不同视野行统计学分析。                                照组(10 ng/mL)相近(图1)。

              A    对照组       Tr 1 pmol/L组  Tr 10 pmol/L组  Tr 50 pmol/L组  Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组  200  *
                                                                                          ( % )  150   *  *
                                                                                          划痕愈合率  100

                                                                                            50
                                                                                             0
                                                                                             对照组
                                                                                            Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
                                                                                                    TGF⁃β 10 ng/mL组
                                                                                                 Tr 50 pmol/L组
                                                                                              Tr 10 pmol/L组
                                                                                          ( % )  800      *  *
              B    对照组       Tr 1 pmol/L组  Tr 10 pmol/L组  Tr 50 pmol/L组  Tr 100 pmol/L组 TGF⁃β 10 ng/mL组
                                                                                          迁移细胞相对比例  400  *
                                                                                           600


                                                                                           200
                                                                                             0
                                                                                            Tr 1 pmol/L组 Tr 100 pmol/L组
                                                                                                 Tr 50 pmol/L组
                                                                                                    TGF⁃β 10 ng/mL组
                                                                                             对照组
                                                                                              Tr 10 pmol/L组
                 A:划痕实验图及半定量分析图(标尺:50 μm);B:Transwell迁移实验图及半定量分析图(标尺:50 μm)。Tr:类胰蛋白酶;与对照组相比,
              P < 0.05;n=3。
              *
                                             图1 类胰蛋白酶促16HBE 细胞修复与迁移
                                   Figure 1  Tryptase promoted the repair and migration of 16HBE cells


              2.2  类胰蛋白酶下调HBE细胞E⁃cadherin、上调N⁃                  (E⁃cadherin)表达降低(P < 0.05,图 2)。故选择
              cadherin及α⁃SMA蛋白表达                                100 pmol/L 浓度进行后续研究。
                  EMT 过程中,往往伴随上皮、间充质细胞特征                        2.3  类胰蛋白酶上调HBE细胞ROS的水平
              标志物水平的变化。蛋白印迹结果显示,不同浓                                  既往肺纤维化研究提示,ROS 是疾病进展的重
              度类胰蛋白酶处理 16HBE 后,间充质细胞标志物                         要信号,胞内ROS水平与EMT诱导密切相关。本研
             (N⁃cadherin 及α⁃SMA)表达上调,上皮细胞标志物                    究采用DCFH⁃DA 探针结合荧光显微镜观察ROS水
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