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第42卷第6期 朱 敏,王红玉,陆琳娟,等. CHL1在支气管哮喘中的表达及意义[J].
2022年6月 南京医科大学学报(自然科学版),2022,42(06):796-801 ·797 ·
附着在基底膜上的具有细胞⁃细胞接触的极化上皮 同期收集18例健康志愿者作为正常对照组,受试者
转化为间充质表型,获得迁移并分泌细胞外基质 均签署知情同意书,并通过南京医科大学第一附属
(extracellular matrix,ECM)的过程,是哮喘气道重 医院医学伦理委员会许可。两组人群均无吸烟者,
塑过程中的重要环节,近年来引起研究者的广泛 且排除过敏性鼻炎、肺结核、肿瘤等病史。哮喘组
关注 。然而目前研究大都着眼于 EMT 中上皮或 男 11 例,女 44 例,对照组男 3 例,女 15 例,哮喘组
[3]
间充质标志物变化,关于迁移特性少有报道,其具 (50.42 ± 1.54)岁,对照组(51.78 ± 1.41)岁,通过卡
体机制尚未明确。 方检验或独立样本t检验分析发现,两组性别、年龄
近来研究表明,神经细胞黏附分子 L1 样蛋白 差异无统计学意义(P=0.755、P=0.631)。
(cell adhesion molecule L1⁃like protein,CHL1)可能 1.2 方法
参与了上皮细胞的 EMT 过程 [4-6] 。现已明确,CHL1 1.2.1 临床资料和血清标本收集
是免疫球蛋白超家族成员,是一种跨膜细胞黏附分 入组时收集受试者临床信息(包括一般情况、
[7]
子 。CHL1 能够通过影响细胞骨架的信号转导途 病史和既往史等),记录哮喘患者稳定期肺功能数
径与细胞内部进行通讯,参与细胞迁移和运动 。研 据,同期采集其血清标本。用含分离胶/促凝剂的真
[7]
究表明CHL1 能通过促进肿瘤细胞 EMT,与细胞侵 空采血管分别采集晨起空腹外周静脉血5 mL,对其
袭和转移密切相关 [5,8] ,且其表达水平与不良预后有 外周血行细胞分类计数。余外周血室温静置20 min,
关 [9-11] ,抑制CHL1表达能减少非小细胞肺癌转移 。 以3 000 r/min、4 ℃离心10 min,获得上层血清,检测
[12]
本研究分别在人体、动物和细胞水平研究 受试者血清CHL1和总IgE水平。
CHL1表达及分布,并探讨其可能调控机制,了解其 1.2.2 慢性哮喘小鼠模型构建
在哮喘中的作用。 随机将动物分为两组:对照组(n=5)和哮喘组
(n=5),分别于第0、7、14天致敏哮喘组小鼠,腹腔内注
1 材料和方法
射鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)+氢氧化铝的混悬液
1.1 材料 4 mL/kg,对照组小鼠腹腔内注射生理盐水4 mL/kg;
SPF级雌性6~8周BALB/c小鼠10只(北京维通 从第16天起雾化吸入5% OVA,1周3 d,共8周。
利华实验动物技术有限公司),饲养于南京医科大学 1.2.3 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immuno⁃
动物实验基地。动物实验均按规范严格进行。人支 sorbent assay,ELISA)
气管上皮细胞株16HBE(购于北京肿瘤研究所)。 采用人 CHL1 ELISA 检测试剂盒,按说明书进
CHL1 抗体(AF2147,R&D 公司,美国),Tubulin 行。将待测血清和试剂缓慢平衡至室温,加样(标准
抗体(AF1216,上海碧云天生物技术有限公司), 品及样本)100 μL至ELISA板内,37 ℃烘箱孵育1 h,
CHL1 抗体(25250⁃1⁃AP,上海 Proteintech 公司),山 甩干,不洗板;加100 μL检测溶液A工作液,37 ℃烘
羊抗兔二抗(GB23303,武汉塞维尔生物科技有限公 箱孵育 1 h,洗板 3 次;再加 100 μL 检测溶液 B 工作
司);人源性重组细胞因子 IL⁃4(BK0245)、IL⁃17 液,于37 ℃烘箱孵育30 min,洗板5次;加入TMB底
(BK0234)、IL⁃1β(BK0094)(Bioworld 公司,美国)、 物溶液 90 μL,37 ℃烘箱避光显色 10~20 min;待标
IL⁃13(213⁃ILB/CF,R&D公司,美国)、TGF⁃β(100⁃21, 准孔蓝色深度合适时,加50 μL终止溶液,置于酶标
PeproTech公司,美国),SYBR(Q311⁃02,南京诺唯赞 仪中,450 nm波长检测每孔光密度值。
生物科技股份有限公司);人CHL1 ELISA检测试剂 1.2.4 免疫组化
盒(SEQ118Hu,武汉云克隆科技股份有限公司), 最后1次OVA 激发后24 h处理小鼠,取每只小
RNA 快速提取试剂盒(上海奕杉生物科技有限公 鼠右下肺最大横径处肺组织,采用石蜡切片机进行
司),逆转录试剂盒(R222⁃01,南京诺唯赞生物科技 连续切片。石蜡切片置于烘箱脱蜡 60 ℃烘 2 h,依
股份有限公司),ECL 化学发光超敏显色试剂盒 次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ浸泡切片 20 min,后梯度浸泡
(36208ES76,上海翌圣生物科技股份有限公司) 于 100%、95%、80%、75%乙醇各 5 min,最后用 PBS
纳入 2018 年 3 月—2019 年 11 月就诊于南京医 浸洗2次,每次5 min。置于有柠檬酸缓冲液的高压
科大学第一附属医院呼吸内科门诊的支气管哮喘 锅中,沸水修复2 min,冷却至室温后,用PBS冲洗2次,
患者 55 例,所有病例诊断标准参照 2018 年全球哮 每次5 min。室温将切片置于3%H2O2溶液15 min以
喘防治倡议(Global Initiative For Asthma,GINA)。 灭活内源性酶,PBS冲洗3次,每次5 min。吸去组织