Page 46 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
               ·798 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年6月


              周围液体，油笔画圈，10%山羊血清室温封闭 1 h，                        内参，比较CHL1的相对表达量。
              PBST冲洗3次，每次5 min。滴加CHL1抗体，4 ℃湿                    1.3  统计学方法
              盒过夜。第 2 天甩去一抗稀释液，PBST 冲洗 3 次，                          应用 GraphPad Prism 9 进行统计学分析，所有
              每次5 min。每个圈内组织滴加100 μL HRP标记的                     定量资料以均数±标准误（x ± sx ），两组资料间的比
              二抗（1∶200稀释）室温孵育1 h，PBST冲洗3次，每次                    较采用独立样本 t 检验，多组资料之间的比较采用
              5 min。每个圈内组织滴加预制好的显色剂 DAB 工                       单因素方差分析，相关性分析采用Pearson直线相关
              作液50 μL，在显微镜下观察显色情况，染色完成后                         分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。
              用蒸馏水洗涤。苏木素30 s染核，立即蒸馏水洗涤，
                                                                2  结 果
              1%盐酸酒精分化，温水返蓝。梯度 75%、80%、
              95%、100%的乙醇脱水，每次5 min；二甲苯Ⅱ、Ⅰ依                     2.1  哮喘患者血清中CHL1表达升高
              次浸泡 10 min。最后用中性树脂封片，盖玻片固定                             对55例哮喘患者和18例健康对照者血清进行
              后在显微镜下观察。                                         ELISA 检测，结果表明，与健康对照者相比，哮喘患
              1.2.5 人支气管上皮细胞（16HBE）培养                           者血清中的CHL1水平增高［（4.174±2.122）ng/mL vs.
                  用含 10%胎牛血清、1%双抗 RPMI1640 培养基                  （7.497 ± 3.274）ng/mL］，差 异 有 统 计 学 意 义（P <
              培养16HBE细胞，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱                     0.000 1，图1）。
              中孵育。隔日换液、待细胞长至 90%时胰酶消化、
                                                                          20
              传代，布入 6 孔板和 12 孔板，待细胞长至密度 80%
                                                                                        ****
              时用无血清RPMI1640培养基饥饿6~12 h。
              1.2.6 实时定量PCR                                               15
                  待细胞铺至 12 孔板并饥饿 6~8 h 后，用人源重                            （ ng/mL）
              组细胞因子 IL⁃4、IL⁃13、TGF⁃β、IL⁃17、IL⁃1β分别刺                       10
              激 16HBE 24 h，以不加干预措施的细胞为对照组。                               血清CHL1
              移去细胞培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清                                     5
              洗细胞后，RNA 快速提取试剂盒提取细胞总 RNA，
              使用逆转录试剂盒逆转录后加入SYBR进行RT⁃PCR
                                                                           0
              实验。扩增条件为下：预变性95 ℃ 30 s→变性 95 ℃                                    对照组（n=18） 哮喘组（n=55）
              5 s→退火 60 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 10 min，共 40 个循                          两组比较， P < 0.000 1。
                                                                                      ****
                                                                     图1   哮喘患者与健康对照组血清CHL1的表达
                                          -ΔΔCT 值，最后比较目
              环。以 GAPDH 为内参，计算 2
                                                                Figure 1  Serum CHL1 expression in asthmatic patients
              的基因在细胞中的相对表达量。所用引物委托南                                      and healthy controls
              京金斯瑞生物科技有限公司合成：人 GAPDH 上游
              引物 5′ ⁃AGAAGGCTGGGGCTCATTTG⁃3′，下游引物               2.2  血清 CHL1 表达水平与肺功能、血清总 IgE 水
              5′⁃AGGGGCCATCCACAGTCTTC⁃3′；人 CHL1 上游              平的相关性分析
              引物 5′⁃TTTTAAATGAAGGAAAGTAAGAAG⁃3′，下                    分别以哮喘患者肺功能指标FEV1、FVC、FEV1/
              游引物5′⁃TCTACTCCCTTCCTAAATTCTAC⁃3′。                 FVC%、血清总IgE水平为横坐标，血清CHL1水平为

              1.2.7 Western blot                                纵坐标，对样本进行相关性分析发现，血清CHL1与
                  细胞辅6孔板并饥饿6~8 h，以人源重组细胞因                       肺功能指标 FEV1、FVC、FEV1/FVC%无明显相关，
              子TGF⁃β刺激16HBE 72 h，经PBS洗3次，用蛋白裂                   而与IgE水平呈正相关（r=0.287，P=0.048，图2）。
              解液提取总蛋白，并用BCA法测得蛋白含量。蛋白                           2.3  CHL1在哮喘小鼠肺组织中的表达

              提取完成后制备SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶，采用80/120 V                          小鼠肺组织免疫组化表明，CHL1在肺组织中主
              恒压电泳，300 mA 恒流转移至 PVDF 膜上；5% BSA                  要表达于支气管上皮细胞，且哮喘小鼠支气管上皮细
              洗涤缓冲液室温封闭2 h；加入Tubulin抗体及CHL1                     胞CHL1表达水平较对照小鼠高（P < 0.05，图3）。
              抗体，4 ℃冰箱孵育过夜；第2天采用TBST缓冲液洗                        2.4 TGF⁃β上调16HBE中CHL1的转录水平
              涤后，用山羊抗兔二抗室温1 h。使用天能凝胶成像                               分别用IL⁃4（20 ng/mL）、IL⁃13（30 ng/mL）、TGF⁃β
              系统，ECL 化学发光超敏显色试剂盒，以 Tubulin 为                    （10 ng/mL）、IL⁃17（20 ng/mL）、IL⁃1β（20 ng/mL）处理
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