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第43卷第1期          骆长亮，张秋红，孙林春. Caspase⁃3抑制剂所致氧化应激状态下肾小管上皮细胞差异表达
                2023年1月           基因的筛选及功能验证［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（01）：017-026                    · 19  ·


                限公司）、MTT试剂盒（南京建成生物工程研究所）、                         95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，共进行 36 个循环；
                细胞凋亡试剂盒（BD公司，美国）、Western blot 一抗                  4 ℃ 10 min。以 5 批独立 cDNA 为模板，每组设 3 个
               （ABI 公司，美国）、Western blot 二抗（上海优宁维生                 复孔，以 GAPDH 为内参基因。根据内参基因和候
                物科技股份有限公司）。荧光定量 PCR 仪（ABI 公                       选基因的CT值，用ΔΔCT法进行基因表达的相对定量
                司，美国）、凝胶成像系统（Bio⁃Rad公司，美国），流式                     分析。
                细胞仪（Beckman公司，美国）。                                1.2.5  CTNNB1表达载体转染HK⁃2细胞
                1.2  方法                                               将 HK⁃2 细胞接种到 6 孔板中，以铺满板底
                1.2.1  芯片样本制备                                     40％密度为宜，用终浓度为 300 μmol/L 的 H2O2处
                    本研究利用H2O2诱导HK⁃2细胞建立氧化应激                       理 6 h 后，将细胞随机分组：对照组（不做处理）、
                状态，通过酶生化法检测 HK⁃2 细胞内的抗氧化指                         caspase⁃3 抑制剂组（Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L）、
                标的含量：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，                CTNNB1 组［pcDNA3.1（+）⁃CTNNB1］、caspase⁃3 抑

                SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和丙二醛（malonic              制剂+CTNNB1 组［Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L+pcD⁃
                dialdehyde，MDA），验证模型是否成功。将对数生长                    NA3.1（+）⁃CTNNB1］以及caspase⁃3抑制剂+CTNNB1

                期的人肾小管上皮细胞 HK⁃2 接种在直径 90 mm                       NC 组［Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L+pcDNA3.1（+）⁃
                的细胞培养皿，用终浓度为 300 μmol/L 的 H2O2 处                  CTNNB1 NC］。转染前1 h更换新鲜培养基，用VigoFect

                理 6 h 后，随机分为对照组（不做处理）和 caspase⁃3                  转染试剂盒，根据操作说明进行转染，将细胞放回
                抑制剂组（Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L），各组设置 3                培养箱培养，6 h后更换新鲜完全培养基。48 h后收
                个独立样本，将样本送公司完成测序及分析。                              集细胞检测转染效率。
                1.2.2  DEG的筛选                                     1.2.6  细胞增殖和凋亡检测
                    本 次 所 用 测 序 平 台 为 Illumina Hiseq 2500，            将 HK⁃2 细胞按 1×10 个/孔接种到 96 孔板，根
                                                                                         3
                100PE。用 R 软件 Affy 包（Version：R3.4.0）的 RMA          据不同分组给予相应处理，在第 0 h 和第 48 h，向
                法通过质控标准过滤去除原始数据中的接头序                              每孔各加入 20 μL MTT 溶液，放在培养箱中培养
                列、低质量数据和未检出碱基等无效数据，得到有                            4 h，取出用酶标仪检测 490 nm 的吸光度，换算成
                效数据；将原始图像数据转化为序列数据。用 R                            存活率，并以时间为横坐标，存活率为纵坐标绘制
                语言的 Limma 包    ［7］ 分析各组基因表达，采用随机                  细胞生长曲线。将 HK⁃2 细胞制成 1×10 个/mL 悬
                                                                                                       5
                方差 t 检验筛选差异基因，计算 P 值并多重检验进                        液，并加入 100 μL 至流式管中，分别加入 20 μL
                行校正，将校正后的 P 值由小到大排列，同时满足                          Annexin⁃FITC 和 PI 染料，避光孵育 20 min 后，加入
                |log2FC（fold change）|≥ 2 和校正 P 值 < 0.05 的基因       500 μL PBS，用涡旋仪震荡混匀后，流式细胞仪检测
                为差异表达基因。用完全链接聚类法（complete⁃                        凋亡细胞百分数。
                linkage clustering）对差异基因进行聚类分析，用                  1.2.7  Western blot检测
                pheatmap 包绘制热图，用ggplot2包做火山图。                         胰蛋白酶消化并收集各组 HK⁃2 细胞，提取总
                1.2.3  GO分析和KEGG通路富集分析                            蛋白，用 BCA 蛋白定量后，加入 1×上样缓冲液煮沸
                    用DAVID数据库 对筛选出的DEG进行GO通                       蛋白 5 min。先用 80 V 恒压电泳 20 min，再 120 V
                                   ［8］
                  ［9］
                路 和KEGG通路       ［10］ 富集分析。当通路上的差异基                恒压电泳 90 min；用硝酸纤维素薄膜 90 V 恒压转
                因数>2个，且矫正后的P < 0.05时，认为富集结果有                      膜120 min。用5％脱脂奶粉封闭蛋白膜2 h，分别用
                统计学意义。                                            1∶1 000稀释的一抗4 ℃孵育过夜和用1∶500稀释的
                1.2.4  候选基因的定量PCR验证                               二抗溶液室温孵育45 min；洗膜后，用显影剂显影并
                    用 TRIzol 试剂盒提取各组细胞的总 RNA，反转                   用凝胶成像系统记录分析蛋白条带。
                录为 cDNA 后，以其为模板，用荧光定量 PCR 仪，用                     1.2.8  细胞ROS检测
                SuperReal PreMix Plus 进行定量 PCR 反应，20 μL 总              胰蛋白酶消化并收集各组 HK⁃2 细胞，将细胞
                体系中包含 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游           制成1×10 个/mL的单细胞悬液，向流式细胞管中加
                                                                           5
                引物（10 μmol/L）各0.6 μL，50×ROX Reference DyeⅡ        入 100 μL 细胞悬液，再加入 5 μmol/L DHE，室温避
                2 μL，cDNA 2 μL，用灭菌去离子水补足体积。定量                     光孵育 30 min，用 PBS 洗涤后，流式细胞仪检测
                PCR 引物序列见表 1。扩增程序为：95 ℃ 15 min；                   ROS。
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