Page 73 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第10期 吴 鑫，音海玲，殷 倩，等. 选择性磁珠纯化法结合高通量测序技术在无创产前筛查中的
2023年10月 应用［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1398-1401，1426 ·1399 ·

标、疾病检出和临床随访情况进行比较分析，为该 冲液洗脱，洗去分选磁珠，完成后续文库构建，采用
技术在NIPT中的临床应用提供依据。 Qubit荧光计测量提取DNA产物的浓度。
1.2.3 上机测序及数据生信分析
1 对象和方法
采用 NextSeq 500AR 高通量测序仪测序，获得
1.1 对象 原始数据直接传递到生信分析工作站；每一个测序
回顾性分析 2019 年 8 月—2021 年 8 月在南 Reads，比对到 NCBI 数据库的 hg19 参考基因组序
京医科大学第一附属医院行 NIPT 检测的孕妇共 列，计算Z值。
20 868 例，其中2019年8月—2020年4月共5 914例 结果判断：以Z值区间在-3.0~3.0，作为13号染
采 用 传 统 纯 化 法 ，2020 年 5 月 —2021 年 8 月 共 色体、18 号染色体、21 号染色体三体型的正常参考
14 954 例采用片段选择富集法。对其中 NIPT 检测 值。≥3.0或≤-3.0为可疑阳性。
高风险者进行介入性产前诊断排除胎儿染色体异 1.3 统计学方法
常，产前诊断孕周为13~23周；所有孕妇均随访分娩 采用 SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析。
结局。样本排除标准：孕周<12周，夫妇一方有明确 符合正态分布的连续变量以均数±标准差（x ± s）
染色体异常，接受过移植手术、干细胞治疗，1 年内 表示，采用 U 检验分析；为排除在效应量微弱情况
接受过异体输血、异体细胞免疫治疗等，胎儿超声 下，因超大样本量而造成的差异有统计学意义的
检查提示有结构异常者，有基因遗传病家族史或提 情况，研究中引入效应量（effect size，以 cohen’s d
示胎儿罹患基因病高风险者，孕期合并恶性肿瘤 表示）来反映组间是否真实存在差异性（cohen’s
者。本研究经医院伦理委员会批准，所有孕妇均进 d < 0.4 提示弱效应，组间不存在差异性；cohen’s d
行检测前咨询、检测原理告知并签署知情同意书。 0.4~0.8 为中等效应，临界区间；cohen’s d >0.8 为强
1.2 方法 效应，组间存在显著性差异）。
1.2.1 样本采集及血浆分离 不符合正态分布的连续变量以中位数（四分位
采集孕妇静脉血5mL于DNA采血管中。1600 r/min 数）［M（P25，P75 ）］表示，分类变量以数值和百分比表
离心10 min，吸取上层血浆，16 000 r/min离心10 min， 示，采用卡方检验或 Fisher 精确检验进行组间比
再次吸取血浆。 较。将 NIPT 结果与胎儿染色体分析结果及妊娠结
1.2.2 血浆cfDNA提取及文库构建 局随访结果进行比对，计算阳性预测值（positive
1.2.2.1 传统纯化法 predict value，PPV），PPV=真阳性病例数/（真阳性病
按照北京安诺优达公司试剂说明书提取血浆 例+假阳性病例），以PPV评估NIPT对胎儿染色体检
游离核酸。简要步骤如下：配制提取液，血浆中加 查的准确性。
入含分离磁珠的提取液，37 ℃孵育后置于磁力架静 2 结 果
置 5 min，混匀后弃上清，清洗；加入缓冲液，混匀静
置后进行文库构建；将从母体血浆中提取的 cfDNA 2.1 孕妇基本资料情况
片段末端修复平整；在3′端加碱基A，碱基的特殊接 共计 20 868 例孕妇纳入研究，其中传统纯化
头连接；通过 PCR 扩增技术，引入带有特定序列标 法组孕妇年龄为（30.40±4.42）岁，片段选择富集法
签的DNA片段，并对各阶段产物进行纯化。 组孕妇年龄为（30.11±4.20）岁（P < 0.001，cohen’s
1.2.2.2 DNA片段选择性磁珠纯化法 d=0.07），两组孕妇年龄无显著差异。传统纯化法
片段选择富集法按安诺优达公司试剂说明书 组孕妇抽血行 NIPT 检测的孕周为（16.59±2.28）周，
进行操作。具体步骤如下：采集静脉血，按传统纯 而片段选择富集法组的孕周为（16.30±1.91）周
化法提取母体血浆中的cfDNA，进行文库构建，修复 （P < 0.001，cohen’s d=0.14），两组间孕周无显著差
DNA，在待分选体系中，按样品∶分选磁珠=1∶1.5 比 异（表1）。
例，加入羧基化纳米磁珠选择吸附大片段 DNA，室 2.2 两种方法cffDNA测序数据质量比较
温混匀，静置10 min；磁力架吸附磁珠，留取上清；按 传统纯化法组中共有 33 例（0.56%，33/5 914）
样品∶分选磁珠=3∶1 比例，在上清中加入分选磁珠 因提取的 cffDNA 浓度过低而需再次抽血检测，而
以选择吸附小片段 DNA，对小片段 cfDNA 进行富 片 段 选 择 富 集 法 组 中 只 有 2 例 因 cffDNA 过 低
集，室温静置，磁力架吸附磁珠，弃上清；清洗后缓 （0.01%，2/14 954）需再次抽血检测，两组间存在显