Page 77 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第10期 孙瑞红，蒋 祝，邵彬彬，等. 三种脊髓性肌萎缩症携带者筛查方法的性能评估［J］.
2023年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1402-1406 ·1403 ·

保健院使用qPCR方法进行SMA携带者筛查的患者 SMN2⁃EX7、SMN1⁃EX8、SMN2⁃EX8和β⁃actin）。
共 516 例，其中，男 12 例，女 504 例，平均年龄为 1.2.4 ddPCR
（31.0±4.0）岁。所有受检者接受遗传咨询后自愿选 使用 ddPCR SMN1 拷贝数测定试剂盒（Bio⁃Rad
择SMA筛查，并排除SMA家族史。每名受检者签署 Laboratories，美国）按照标准操作流程进行操作。
知情同意书，本研究经南京市妇幼保健院伦理委员 18 μL 体系中含有 2×ddPCR Supermix for Probes、
会批准（编号：2020KY004）。 20×ddPCR SMN1 Assay 和 HaeⅢ，并加入 4 μL DNA
1.2 方法 样品。然后，取 20 μL 混合物与 70 μL 的 Bio⁃Rad
抽取每名受检者外周血2 mL，使用自动核酸提 Droplet Generation Oil for Probes 混 合 ，在 Bio ⁃ Rad
取仪（厦门芮宝生医股份有限公司）提取基因组 QX200 Droplet Generator 上生成液滴。液滴产生
TM
DNA，用下列方法对SMN拷贝数进行检测。 后进行终点PCR。PCR 的热循环条件如下：95 ℃下
1.2.1 MLPA 10 min；94 ℃下 30 s，55 ℃下 1 min，35 个循环；98 ℃

MLPA 分析使用 SALSA MLPA 试剂盒（P060⁃ 下10 min。Quanta Soft Analysis Pro软件以核糖核酸
050R，MRC 公司，荷兰）按照标准操作流程进行检 酶 P/MRP 亚 单 位 p30（RPP30）为 参 考 基 因 进 行
测。该试剂盒包含2个针对SMN1第7号和第8号外 SMN1第7号外显子的液滴集群分类和拷贝数计算。
显子的序列特异性探针和 1 个针对 SMN2 第 7 号和 1.3 统计学方法
第8号外显子的探针。DNA变性后与MLPA探针混 每种方法检出的 SMN1 和 SMN2 拷贝数录入
合物杂交过夜，然后进行探针连接和扩增。使用 Microsoft Office Excel 软件进行数据分析。灵敏度=
ABI 3500分析仪（赛默飞世尔科技公司，美国）对扩 真阳性样本/（真阳性样本+假阴性样本）×100%。特
增产物进行检测，并使用 Coffalyser.Net 软件（MRC 异度=真阴性样本/（真阴性样本+假阳性样本）×100%。
公司，荷兰）分析数据。探针相对峰面积增加或减 本研究中 2 分类结果采用灵敏度和特异度进行评
少30%分别表示重复或删除。 价。3 分类/4 分类变量采用加权 Kappa 系数进行一
1.2.2 HRM 致性检验，加权 Kappa 一致性检验分析采用 SPSS
采用 2 次多重探针 PCR 反应检测 SMN1 基因拷 26.0 软件包进行。Kappa 值是介于 0 到 1 之间的一
贝 数 。 20 μL 反 应 体 系 包 含 100~200 ng 基 因 组 个比率，其中0表示完全不一致，1表示完全一致。
DNA、1×PCR 缓冲液、0.5 μmol/L 引物、KlenTaq1 聚
2 结 果
合酶和 LCGreen 染料。PCR 反应在 LightCycler 480
（罗氏诊断公司，德国）上扩增：95 ℃ 5 min，95 ℃ 为了系统地比较目前用于SMA携带者筛查的方
5 s，64 ℃降温至 60 ℃ 30 s，共 10 个循环，随后 95 ℃ 法 ，同 时 用 MLPA、ddPCR、HRM 和 PCR/CE 检 测
10 s，60 ℃ 15 s，共 25 个循环。扩增后产物 95 ℃预 516 份 DNA 样本。以 MLPA 结果为金标准，计算
热60 s，40 ℃孵育60 s收集熔解曲线进行分析。 ddPCR 、HRM 和 PCR/CE 检测方法的灵敏度和特
1.2.3 PCR/CE检测 异度。
使用 PCR/CE 试剂盒（厦门百欧迅公司）检测 2.1 灵敏度和特异度
SMN1 基因拷贝数。该试剂盒包含 SMN1 和 SMN2 针对SMN1第7号外显子，MLPA结果显示，107
基因第 7 号和第 8 号外显子的引物，β⁃globin 和β⁃ 个样本为杂合性缺失（SMN1第7号外显子单拷贝），
actin 作为内参。20 μL 反应体系包含 15 μL PCR 混 409 个样本为正常（SMN1 第 7 号外显子≥2 拷贝）。
合物，3 μL 引物，0.16 μL DNA 聚合酶，和 2 μL 基 与 MLPA 结果相比，ddPCR、HRM 分析和 PCR/CE 检
因组 DNA。使用热循环仪，条件如下：95 ℃初始 测 SMN1 第 7 号外显子的拷贝数与 MLPA 分析结果
孵化 5 min，然后进行 25 个扩增循环（95 ℃ 30 s， 一致，灵敏度和特异度均为100.0%（表1、2）。
57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），最后在 72 ℃下延伸 30 min。 表1 HRM分析SMN1第7号外显子拷贝数
然后，将 PCR 产物与 Hi⁃Di Formamide（赛默飞世尔 HRM分析结果（n）
MLPA检 灵敏度 特异度
科技公司，美国）和 GeneScan 500 LIZ Size Standard 1拷贝 ≥2拷贝
测结果 （%） （%）
混合。变性后，混合物在 ABI 3500 遗传分析仪（赛 （n=107） （n=409）
默飞世尔科技公司，美国）上分离。通常情况下， 1拷贝（n=107） 107 000 100.0 100.0
得到的电泳图包括 6 个峰（β⁃globin、SMN1⁃EX7、 ≥2拷贝（n=409） 000 409 100.0 100.0