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第43卷第2期        汤序军，王红顺，姚 俊，等. ApoE敲除导致小鼠耳蜗螺旋神经元功能损伤的相关性分析［J］.
                  2023年2月                    南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：156-163，168                     ·157 ·


                究提示，ApoE 功能缺陷也会影响个体的听觉功能，                         剂（P0012，上海碧云天公司）；基因扩增引物由北京
                ApoE的脂质转运功能受损，会造成内耳组织结构的                          擎科生物科技有限公司合成。
                损伤 。本课题组前期研究发现，ApoE基因缺陷小                          1.2  方法
                    ［6］
                鼠在出现听力阈值上升的同时，还存在听性脑干反                            1.2.1 组织标本采集
                应（auditory brainstem response，ABR）波形的异常，              选择实验小鼠及同窝对照小鼠，麻醉后使用
                且 ABR 波形出现波Ⅰ振幅缩短及延迟期延长的现                          0.9%生理盐水心脏灌注，取出小鼠耳蜗组织，置于
                象，提示内毛细胞（inner hair cell，IHC）与螺旋神经                4%多聚甲醛固定。固定过夜后将耳蜗组织置于
                节神经元（spiral ganglion neurons，SGN）连接处的带            5% EDTA脱钙液中脱钙7~10 d。
                状突触（ribbon synapse）以及 SGN 内的听神经纤维                 1.2.2 ABR检测及波Ⅰ分析

                可能发生了损伤，但围绕 ApoE 与带状突触及 SGN                           小鼠麻醉后放置于隔音箱中，ABR检测使用美
                损伤的机制尚不清楚。                                        国 TDT 公司设备及 BioSigRZ 软件系统给声并采集
                    为探究ApoE 基因缺失是否会引起SGN 内听神                      信号。纯音通过开放声场MF1磁性扬声器传送，扬
                经及带状突触损伤，并揭示其可能的作用机制，本                            声器置于距外耳道 5 cm 处。参考电极置于给声耳
                研究首先对ApoE 基因敲除的小鼠听觉功能进行了                          廓后，记录电极置于两耳间连线中点，地电极置于
                检测，明确其听力损失情况，并分析了 ABR 的波形                         对侧耳廓后。测试声强从90 dB开始，以10 dB逐步
                特征；其次对耳蜗螺旋神经节内带状突触及听神经                            递减，每个声级重复叠加 512 次取均值。一般小鼠
                的病理表型进行检测；最后通过实验解释 ApoE 缺                         ABR由5个波组成，以其中重复性最好、最稳定的Ⅱ
                陷引起听神经及带状突触损伤可能的分子基础，从                            波作为波群主波，Ⅱ波最后消失的声强作为反应
                而揭示ApoE缺失引起听力损失的作用机制。                             阈，记录 Click 刺激以及纯音刺激在 4、8、16、24、
                                                                  32 kHZ 频率下的ABR阈值 。在每个频率90 dB水
                                                                                          ［7］
                1  材料和方法
                                                                  平上测量Ⅰ波波峰至基线距离即Ⅰ波振幅，测量Ⅰ
                1.1  材料                                           波波峰至波群起始点时长即Ⅰ波潜伏期。
                    用于实验的 ApoE 小鼠购自南京大学模式动                        1.2.3 HE染色
                                    -/-
                物研究所，由南京医科大学动物中心净化并配繁。                                脱钙后的耳蜗样本梯度酒精中脱水，二甲苯溶
                实验经过南京医科大学实验动物福利伦理委员会                             液透明组织，浸蜡2~3 h后进行石蜡包埋，切成5 μm
                同意（ACUC⁃2002003）。                                 的薄片。60 ℃烘干后经过二甲苯及梯度酒精脱蜡，
                    实验所用抗体包括：Ctbp2 抗体（612044，BD                   切片经苏木素染色5~8 min，1%盐酸酒精分化2~5 s，
                Biosciences 公司，美国），NF⁃H 抗体（ab207176，Ab⁃           0.6%氨水返蓝。再放入伊红染液 1~3 min，脱水后
                cam公司，美国），Map2抗体（8707，CST公司，美国），                  中性树脂封片，显微镜下观察HE染色结果。
                Phospho⁃PI3K 抗体（AP0854）、PI3K 抗体（A19742）、          1.2.4 免疫荧光染色
                Phospho⁃Dab1 抗体（AP0929）、Dab1 抗体（A10349）、              脱钙后的耳蜗组织样本，在体视显微镜下分离
                Phospho⁃Cofilin1 抗体（AP0178）、Phospho⁃Akt1 抗体       耳蜗基底膜，清洗后使用 0.3%Triton X⁃100 透膜处
               （AP063）、Phospho⁃Limk1 抗体（AP0387）、Limk1 抗           理20 min。耳蜗石蜡切片样本脱蜡后经柠檬酸盐缓
                体（A16664）（武 汉 ABclonal 公 司），cofilin1 抗 体          冲液抗原修复，自然冷却后 PBS 缓冲液清洗，0.1%
               （5175，CST 公司，美国），Akt 抗体（10176）、山羊抗                 TritonX⁃100 透膜处理 20 min。样本经 Triton X⁃100
                鼠、抗兔 IgG 二抗（SA00001⁃1、SA00001⁃2）（武汉               透膜处理后，使用 10%山羊血清室温封闭 1 h，4 ℃
                Proteintech 公司），荧光标记山羊抗鼠、抗兔二抗                     孵育一抗过夜。次日PBS清洗，避光37 ℃孵育二抗
               （1741782、1748346，Thermo公司，美国）。                     1 h，PBS清洗后使用含DAPI 的抗淬灭封片剂封片，
                    其他包括：苏木素、伊红染液（G1004、G1001，武                   荧光显微镜下观察染色情况。
                汉 赛 维 尔 公 司）、SYBR Green Master Mix（2x）            1.2.5 蛋白质免疫印迹
                                        ®
               （Q131，南京 Vazyme 公司）、TGX Stain⁃Free      TM  Fast⁃      取小鼠耳蜗组织，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA
                   TM
                Cast Acrylamide Kit12%预混胶（1610185TA，Biolab        裂解液进行组织匀浆，提取总蛋白，使用 BCA 试剂
                                     ®
                公 司 ，美 国）、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR         盒进行蛋白浓度定量。取等量蛋白，通过12% SDS⁃
               （R323⁃01，南京Vazyme公司）、BCA蛋白浓度检测试                    PAGE 电泳分离蛋白，并转移至 PVDF 膜上。在 5%
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