Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第2期
·158 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年2月

脱脂奶粉溶液中封闭 2 h，TBST 清洗后，4 ℃孵育一 表1 实时定量PCR引物序列
抗过夜。TBST 清洗后 37 ℃孵育二抗 2 h，清洗后加 Table 1 Primer sequences of qRT⁃PCR
ECL发光液，使用凝胶成像系统观察。 基因 序列（5′→3′）
GAPDH 上游AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
1.2.6 实时定量PCR
下游TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
取小鼠耳蜗组织，使用 TRIzol 在组织匀浆器中
VldlR 上游GGCAGCAGGCAATGCAATG
提取总 RNA，测量浓度后取 1 μg 总 RNA 进行反转
下游GGGCTCGTCACTCCAGTCT
录，生成 cDNA 保存，随后进行实时定量 PCR 检测。
ApoER2 上游CCAATGGAATCACCCTGGACT
采用 20 μL 扩增体系：SYBR Green Master Mix（2x） 下游CTTTGGCTCGTTCAGCTCG
®
10 μL，cDNA 1 μL，上游引物与下游引物各 0.5 μL， Lrp1 上游GCGGTGTGACAACGACAATG
ddH2O 8 μL。扩增程序如下：预变性 95 ℃ 5 min， 下游AGCCACCAGGAGGTCTTGTA
变性 95 ℃10 s，退火/延伸 60 ℃ 30 s，共 40 个循
环。目标基因 CT 值使用 Gapdh 基因校正，引物序 失，判断该小鼠听力阈值为40 dB（图1A、B）。对3、
列见表 1。 12及24周的WT及ApoE 小鼠ABR阈值统计发现，
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1.3 统计学方法 ApoE 小鼠与对照组相比，在Click刺激下，3周龄时
使用 GraphPad Prism 软件进行相关统计学分 并没有明显的阈值差异；但随着小鼠周龄增加，从
析，每组实验至少重复3次。实验数据采用均数±标 12 周龄开始，ApoE 小鼠听力阈值出现显著上升
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准差（x ± s）表示，采用两独立样本t检验进行组间比 （图 1C）。ApoE 小鼠在 4~32 kHZ 频率下进行纯音
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较，P < 0.05为差异有统计学意义。 听力阈值的分析，发现 ApoE 小鼠在 3 周时表现出
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正常的听力阈值，与 WT 组相比没有明显差异（图
2 结 果
1D）。12 周龄 ApoE 小鼠在高频听力区域（24、
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2.1 ApoE 小鼠ABR检测 32 kHZ）处出现听力阈值的显著增高（图 1E）。
根据前文 ABR 检测阈值判断方法对两组小鼠 在 24 周龄时，相比于 WT 组，ApoE 小鼠的听力阈
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听力阈值进行统计，图中波形可以看出 12 周龄的 值从 8 kHZ 开始就出现明显上升，并且高频区域听
WT 小鼠在 24 kHZ 频率刺激下，波Ⅱ在 20 dB 时依 力损失更加严重（图1F）。这些听力检测结果显示，
然存在，故其听力阈值为 20 dB 。而同样条件下， ApoE 小鼠从12周开始便出现了听力损失，随着年
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ApoE 小鼠在 40 dB 时存在波Ⅱ，30 dB 时波Ⅱ消 龄增加情况逐渐严重，并且从高频区域开始受损，
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A B C
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Click刺激 WT
90 dB 90 dB ApoE -/-
80 dB 80 dB （ dB SPL ） 80 **
60
70 dB 70 dB *
60 dB 60 dB 40
50 dB 50 dB
40 dB 40 dB ABR阈值
30 dB 30 dB 20
20 dB 20 dB
WT ApoE -/- 0
3周龄12周龄24周龄
D WT E 80 WT F 80 WT ***
（ dB SPL ） 80 ApoE -/- （ dB SPL ） 70 ApoE -/- ** ** （ dB SPL ） 70 ApoE -/- ** ***
70
60
60
60
**
50
50
50
ABR阈值 40 ABR阈值 40 ABR阈值 40
30
30
30
20
20
20
10
0 3周龄 10 0 12周龄 10 0 24周龄
4 8 16 24 32 4 8 16 24 32 4 8 16 24 32
频率（kHZ） 频率（kHZ） 频率（kHZ）
A、B：ABR检测WT小鼠（A）和ApoE 小鼠（B）波形图（12周龄，24 kHZ频率）；C：Click刺激下WT组与ApoE 组听力阈值比较；D、E、F：3周
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龄（D）、12周龄（E）和24周龄（F）的两组小鼠在纯音刺激下各频率的听力阈值。两组比较，P < 0.05，P < 0.01， P < 0.001（n=6）。
**
*
***
图1 ApoE 小鼠ABR检测
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Figure 1 ABR detection in the ApoE mice
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