Page 28 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第2期
               ·170 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


                  替格瑞洛是一种新型抗血小板聚集药物，无需                          司）；流式细胞仪（Millipore公司，美国）。
              通过肝脏代谢活化，可直接抑制血小板 P2Y12 受                         1.2  方法
              体，减少ADP的结合位点 。大量研究表明，与氯吡                          1.2.1 血清ET⁃1、NO含量测定
                                    ［1］
              格雷相比，替格瑞洛能显著降低急性冠脉综合征                                  采集ACS患者双联（阿司匹林+替格瑞洛或阿司
             （acute coronary syndrome，ACS）患者的病死率 。因             匹林+氯吡格雷）治疗前及治疗后1个月的外周静脉
                                                      ［2］
              此，替格瑞洛目前已成为指南推荐的ACS抗血小板                           血 5 mL，常温下 3 000 r/min 离心 10 min，收集上清
              聚集首选药物 。                                          液，-80 ℃冰箱保存。采用 ELISA 试剂盒检测血清
                          ［3］
                  有研究者认为替格瑞洛改善 ACS 患者预后不                        ET⁃1的含量，按照NO检测试剂盒的说明书检测NO
                                                ［4］
              单纯依赖其强效的抗血小板聚集作用 。血管内皮                            的含量。研究经南京中医药大学附属医院伦理委
              功能障碍在冠心病的发生发展中起着重要的作用，                            员会批准且研究对象知情同意（伦理批准文号：
              有研究发现替格瑞洛可能还具有改善血管内皮功                             2021NL⁃130⁃02）。
              能的作用，但具体机制尚未明确               ［5-6］ 。p16 基因是一      1.2.2 HUVEC培养
              种调控细胞周期的重要基因，其编码产物 p16 蛋白                              HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL
              直接调控细胞周期 G1~S 转换，负调节细胞增殖及                         的青霉素和链霉素的内皮细胞专用培养基，置于含
              分裂，并促进细胞凋亡和衰老 。                                   5% CO2的37 ℃细胞培养箱中。隔天换液，于细胞密
                                        ［7］
                  本文研究替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白（ox⁃                        度80%左右时，胰酶消化传代、种植细胞。
              idized low⁃density lipoprotein，ox⁃LDL）诱导血管内皮      1.2.3 基因过表达、敲除与细胞转染
              细胞损伤的保护作用，并探讨 p16 基因在替格瑞洛                              p16 过表达构建于慢病毒载体 pcDNA⁃EGFP。
              保护内皮功能中的作用及潜在机制。                                  p16 DNA 片段从 HEK293 的 cDNA 中通过 PCR 扩增
                                                                获取。PCR 的反应体系如下：2 μL cDNA；10 μL 2×
              1  材料和方法
                                                                qPCR mixture；1 μL 上下游引物（10 μmol/L）；6 μL
              1.1  材料                                           无菌蒸馏水。real⁃time PCR 的反应程序如下：预变
                  人内皮素1（endothelin⁃1，ET⁃1）elisa 试剂盒（厦           性，95 ℃，5 min；变性，95 ℃，5 s；退火，56 ℃，30 s；延
              门仑昌硕生物科技有限公司）；一氧化氮（nitricox⁃                      伸，72 ℃，30 s；40 个循环。PCR 引物采购于上海捷
              ide，NO）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公                         瑞 生 物 工 程 有 限 公 司 。 p16：正 义 5′ ⁃ CCG⁃
              司）；替格瑞洛（阿拉丁公司，中国）；人脐静脉内皮                          GAATTCATGGGTCGCAGGTTCTTGG ⁃ 3′ ，反 义 5′ ⁃
              细 胞（human umbilical endothelial cell，HUVEC）、      CGCGGATCC⁃CTATGCCCGTCGGTCTGG⁃ 3′。PCR
              EdU 检测试剂盒、RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白定量                     产物连接到带有 EcoRⅠ和 BamHⅠ位点的 pcDNA⁃
              试剂盒、ECL 底物发光液、无血清冻存液、内皮细胞                         EGFP载体中。
              培养液（苏州君欣生物科技有限公司）；细胞凋亡检                                针对 DNMT1 和 p16 的特定短发夹 RNA（shDN⁃
              测试剂盒（Roche 公司，美国）；Transwell 迁移小室                  MT1和shp16）与对照短发夹RNA（shNC）由上海Ge⁃
             （Corning公司，美国）；TRIzol RNA提取试剂、逆转录                  nePharma 设计和合成。将短发夹 RNA 连接到慢病
              试剂和Real⁃time PCR试剂（江苏康为世纪生物科技                     毒载体pLKO.1中AgeⅠ/EcoRⅠ位点。shDNMT1⁃1：
              有限公司）；抗 DNMT1、p16 和β⁃Actin 抗体（Abcam               5′⁃GGATGAGTCCATCAAGGAAGA⁃3′；shDNMT1⁃2：
              抗体，美国）；CCK⁃8 检测试剂盒、基因组 DNA 提取                     5′⁃GCACCTCATTTGCCGAATACA⁃3′；shDNMT1⁃3：
              试剂盒、Taq DNA 聚合酶、琼脂糖胶（北京天根生化                       5′⁃GGGCAAGCCCAAGTCCCAAGC⁃3′；shp16⁃1：5′⁃
              科技有限公司）；EZ DNA Methylation⁃Gold Kit 甲基            GGGAGCAGCATGGAGCCTTCG ⁃ 3′ ；shp16 ⁃ 2：5′ ⁃

              化试剂盒（Zymo Research公司，美国）；Lipofectamine            GCTGCCCAACGCACCGAATAG ⁃ 3′ ；shp16 ⁃ 3：5′ ⁃
              2000（Invitrogen 公司，美国）；胰酶和青霉素/链霉素                 GCAGTAACCATGCCCGCATAG⁃3′。
             （Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；全功能酶标仪、细胞培                        用 Lipofectamine⁃2 000 将病毒质粒转染进 293T
              养箱（Thermo公司，美国）；生物安全柜（江苏苏净集                       细胞中，72 h 后收获病毒并感染 HUVEC，感染 72 h
              团有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；超                      后进行后续实验。
              高速低温离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公                             1.2.4 CCK⁃8法检测细胞活力
              司）；超低温冰箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公                               HUVEC以1×10 /孔种植于96孔细胞培养板，每
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