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第43卷第2期 朱伯谦，宋兵战，陈 凯，等. DNA甲基化调控p16表达在替格瑞洛改善血管内皮功能中的
2023年2月 作用及机制［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：169-178 ·171 ·
孔加入 10 μL CCK8 试剂，培养箱中继续培养 2 h， 量试剂盒检测蛋白浓度。采用 10%的聚丙烯酰胺
弃去培养液，每孔加入 200 μL DMSO，室温振荡 凝胶（SDS⁃PAGE）进行电泳，电泳条件：浓缩胶为恒
15 min，在酶联免疫检测仪上振荡10 s，检测450 nm 压100 V，30 min；分离胶为恒压120 V，1 h。将蛋白
波长处的吸光值（OD 值）。统计、分析各组细胞的 条带转印至 PVDF 膜，转膜条件：恒压 100 V，1 h。
活力。 采用5%的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。将膜与一抗
1.2.5 EdU法检测细胞增殖 （抗 DNMT1、p16 和β⁃actin 抗体）孵育，4 ℃，过夜。
HUVEC以5×10 /孔种植于48孔细胞培养板，加 TBST溶液洗膜，室温，5 min，3次。将膜与辣根过氧
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入EdU，培养箱中继续培养2 h。弃去EdU，4％多聚 化物酶标记的二抗孵育，室温，1 h。ECL 底物发光
甲醛固定 30 min，0.5％Triton X⁃100 穿透 15 min，并 液检测蛋白质条带。内参基因为β⁃actin。Image J
加入染色反应液避光孵育30 min，Hoechst染核。随 软件分析蛋白质条带信号强度。
机观察5个高倍视野，计数阳性染色细胞数，取平均 1.2.10 甲 基 化 特 异 性 PCR（methylation ⁃ specific
值。统计、分析各组细胞的增殖情况。 PCR，MSP）法测定p16基因启动子区甲基化水平
1.2.6 Transwell法检测细胞迁移 DNA提取试剂盒提取细胞的基因组DNA，甲基
将 Transwell 小室装置放置于 24 孔细胞培养板 化试剂盒进行基因组 DNA 甲基化转化。Taq DNA
中，HUVEC 干预后经消化并重悬于含 1%血清的培 聚合酶进行 PCR 实验，PCR 的反应体系如下：2 μL
养基中，按照5×10 /孔种植于Transwell小室中，下室 cDNA；10 μL 2×PCR mixture；1 μL 上 下 游 引 物
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加入含10%血清培养基；细胞培养箱培养过夜后取 （10 μmol/L）；36 μL 无菌蒸馏水。real⁃time PCR 的
出 Transwell 小室，棉棒擦除上室滤膜上层细胞，下 反应程序如下：预变性：95 ℃，5 min；变性：95 ℃，5 s；
层细胞经4%多聚甲醛室温固定15 min，室温晾干后 退火：56 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s；40个循环。PCR
予以0.1%结晶紫室温染色30 min，移行细胞呈蓝紫 产物采用1%的琼脂糖胶进行电泳，电泳条件：100 V，
色，随机观察 5 个高倍视野，计数移行细胞数，取平 30 min。手持式紫外灯照射后拍照记录结果。引物
均值。统计、分析各组细胞的迁移情况。 采购于上海捷瑞生物工程有限公司。甲基化引物：
1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 正义 5′⁃TTTAGAATGTTGGGATTATAGACGT⁃3′，反
HUVEC干预后经胰酶消化并重悬，离心后用预 义 5′⁃AAAAAACTAAAACAAAAAAATCGCT⁃3′。未
冷的标记缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为（0.5~ 甲基化引物：正义 5′⁃TTTAGAATGTTGGGATTATA⁃
1.0）×10 /mL，依次加入 Annexin V⁃FITC 和 PI 染色 GATGT⁃3′，反义 5′⁃AAAAAACTAAAACAAAAAAA⁃
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液，避光孵育20 min，再加入400 μL标记缓冲液，用 TCACT⁃3′。
流式细胞仪对细胞凋亡进行分析。统计、分析各组 1.3 统计学方法
细胞的凋亡情况。 采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析。所有实
1.2.8 荧光定量PCR法测定DNMT1、DNMT3α、DN⁃ 验均重复 3 次。两两比较用双尾 Student’s t⁃test 进
MT3β、p16基因表达 行分析；多组比较采用 Prism 软件中的方差分析及
TRIzol 试剂提取各组细胞的总 RNA，逆转录试 多重比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
剂盒将总RNA逆转录成cDNA。real⁃time PCR 法检
2 结 果
测DNMT1、DNMT3α、DNMT3β、p16基因的表达。内
-ΔΔCT 治疗前后人血清ET⁃1、NO水平比较
参基因为β⁃actin。基因的相对表达量通过公式2 2.1
计算。real⁃time PCR引物采购于上海捷瑞生物工程 为研究替格瑞洛的治疗作用，通过 ELISA 实验
有限公司。DNMT1：正义 5′⁃GTCTGCTCCTGCGTG⁃ 检测替格瑞洛治疗前后人血清 ET⁃1 和 NO 含量，发
GAAG ⁃ 3′ ，反 义 5′ ⁃ CTGAAGAAGCCGTCCCACTC ⁃ 现两组患者治疗前ET⁃1和NO含量均无显著性差异
3′。p16：正义 5′⁃CTTGGTGACCCTCCGGATTC⁃3′， （P＞0.05，表1）；治疗1个月后，替格瑞洛组ET⁃1含
反义 5′⁃TCAGTAGCATCAGCACGAGG⁃3′。β⁃actin： 量显著低于氯吡格雷组，而血清 NO 含量则显著高
正义 5′⁃TCTGGCACCACACCTTCTA⁃3′，反义 5′⁃AG⁃ 于氯吡格雷组（P < 0.05，表 1），结果表明替格瑞洛
GCATACAGGGACAGCAC⁃3′。 对血管内皮功能有保护作用。
1.2.9 Western blot法测定DNMT1、p16蛋白表达 2.2 替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤的影响
RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定 为研究替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤
