Page 72 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 72

第43卷第2期
               ·214 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


                  幼鼠因超排效果稳定、卵子数量多，被广泛用                          龄发情鼠与有交配经验并停配1周的雄鼠合笼，次日
              于早期胚胎的研究以及基因工程编辑模型鼠的建                             8：00检阴道栓，见交配栓的小鼠入选实验组。
              立 ［6-7］ 。相对而言，成年鼠超排受内源性激素的影响                      1.2.2 小鼠超排方案
              较大，相关研究资料报道较少，但对于卵细胞质量                                 自然排卵对照组：自然受孕，不进行激素超
              要求比较高的科学研究和在拯救濒危品系时操作                             排。在16：00挑选发情鼠，16：30与有交配经验并停
                               ［8］
              的对象为成年小鼠 。成年雌鼠交配后 10~12 h 阴                       配1周的雄鼠1∶1合笼，次日检栓。
              道口有白色的阴道栓，交配后小鼠的黄体会变为功                                 随机超排对照组：第1天16：00 注射PMSG，第3
              能性黄体，小鼠的发情周期停止。有研究报道，雌                            天16：00（间隔48 h）注射HCG促排卵，16：30与有交
              鼠在发情周期的不同阶段注射PMSG均可以诱导超                           配经验并停配1周的雄鼠1∶1合笼，次日检栓。
                    ［9］
              数排卵 ，长期从事生物净化的过程中发现妊娠期                                 常规双排卵实验组：见栓当天（第1天）16：00注
              小鼠也可通过超排获得受精卵。ICR 小鼠是用                            射PMSG，第3天16：00（间隔48 h）注射HCG，第4天
              Swiss小鼠群以多产为目标进行选育的小鼠品系，经                         9：00取胚胎（图1A）。

              美国癌症研究所分送各国饲养实验。本研究以ICR                                优化双排卵实验组：见栓当天（第 1 天）9：00 注
              野生型雌鼠为实验对象，在其自然受孕当日再进行                            射PMSG，第2天17：00（间隔32 h）注射HCG后再次
              超排操作，探讨同时获得卵细胞和多细胞胚胎（一                            与停配1周的雄鼠1∶1合笼，第3天8：00检栓，见栓
              次自然受孕的受精卵在超排期间继续发育的胚胎）                            鼠和未见栓鼠分开取卵（图1C）。
              的可行性，然后对二次募集成熟卵细胞的超排方案                            1.2.3 卵母细胞和早期胚胎的收集
              进行优化，深挖成年小鼠超排效果和胚胎发育的潜                                 用颈椎脱臼法处死小鼠，剖宫依次取输卵管和
              能，为充分利用小鼠资源从超排卵中获得最大收益                            子宫，将输卵管置于覆盖石蜡油的M2培养液（提前
              提供了高效、可行的实验方案。                                    置于37 ℃，5% CO2培养箱预温）内，用眼科镊撕破壶
                                                                腹部释放卵细胞团，经0.1%透明质酸酶消化颗粒细
              1  材料和方法
                                                                胞，洗涤3次后统计所有多细胞的胚胎以及受精、未
              1.1  材料                                           受精、死亡和异常卵母细胞的数量。采用1 mL注射
                  ICR 雌鼠为 10~15 周，ICR 雄鼠为 10~20 周有生             器抽取 37 ℃预热的 M2 冲洗子宫，检查输卵管内是
              育能力且停配至少 1 周，均来源于上海斯莱克实验                          否存留正常发育的胚胎，记录囊胚数、退化卵数和
              动物有限公司，按照 SFP 级标准饲养于南京医科大                         取到囊胚的小鼠只数。受精率=见栓鼠受精卵数/见
              学医药实验动物中心屏障系统，符合南京医科大学                            栓鼠排卵总数×100%。
              实 验 动 物 伦 理 管 理 规 范（伦 理 号 ：IACUC ⁃                1.2.4  外源PMSG对自然受孕一次胚胎发育影响的
              2205051）。自由饮水，室温（22±1）℃，光照 12 h/d，                观察
             （7：00~19：00）。                                           自然交配见栓鼠于 9：00 注射 PMSG，分别在
                  超净工作台（苏州苏净公司），CO2恒温培养箱                        8、24、32、48 h 后对输卵管胚胎数量进行观察，记录
             （Thermo 公司，美国），体视显微镜（SZX10⁃3151，                   各时间点自然排卵胚胎数量的变化（图1B），并于见
              Olympus 公司，日本）、35 mm及60 mm培养皿（Corn⁃               栓24、48、80 h分别对2细胞、8细胞及囊胚期不同阶
              ing公司，美国）；注射用PMSG、注射用HCG（北京启                      段胚胎发育进行观察记录。

              维益成科技有限公司），石蜡油（货号 M8410，Sigma                     1.3  统计学方法
              公司，美国），M2培养液（货号M7167，Sigma公司，美                         采用SPSS 25.0进行数据的统计学分析，各实验
              国），透明质酸酶（货号H4272，Sigma公司，美国）。                     组间排卵计数资料均采用单因素方差分析进行检

              1.2  方法                                           验。P＜0.05为差异有统计学意义。
              1.2.1 试验分组和激素注射剂量
                                                                2  结 果
                  10~15周龄的C57BL/6J雌鼠种群内随机挑选，按
              照采取的超排方案分为4个试验组。自然排卵对照                            2.1  各实验组排卵数量的比较
              组、随机超排对照组、常规双排卵实验组、优化双排卵                               自然排卵对照组、随机超排对照组、常规双排
              实验组。所有超排组小鼠按照每只7.5 U PMSG促卵                       卵实验组共入组22只小鼠，各组小鼠排卵的情况详
              泡发育，7.5 U HCG促排卵。实验组小鼠入组条件：适                      见表1。自然排卵对照组和随机超排对照组的平均
   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77