Page 30 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
               ·612 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


                  乳腺癌（breast cancer，BCa）是全球范围内女                 诺唯赞）逆转录为cDNA，然后对目的基因进行qRT⁃
              性最常见的恶性肿瘤，复发和转移是导致乳腺癌患                            PCR扩增（SYBR Green Ⅰ，上海翊圣）。所用引物序
              者治疗失败的主要原因          ［1-2］ 。尽管近年来乳腺癌的诊             列 为 ：β ⁃ actin 上 游 引 物 5′ ⁃ AGATGTGATCAG⁃
              断和治疗手段已经取得了巨大进步，但乳腺癌的发病                           CAAGCAG⁃3′，下游引物5′⁃GCGCAAGTTAGGTTTT⁃
              率仍高居不下，其发病机制尚未完全阐明。                               GTCA ⁃ 3′ ；人 RP11 ⁃ 490M8.1 上 游 引 物 5′ ⁃ CTCT⁃
                  长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）          GCTTTCTGTGCCAAGG⁃ 3′，下游引物 5′⁃AAACC⁃
              是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA。大量                          CACCACT⁃TTTGTCCG⁃3′。
              研究表明，lncRNA 在多种肿瘤中异常表达，并通过                        1.2.2 细胞转染及稳转细胞构建
              多种机制参与包括乳腺癌在内的肿瘤发生发展过                                  RP11⁃490M8.1 表 达 质 粒 为 本 实 验 室 构 建 ，
              程 ［3-5］ 。例如，lncRNA TTN⁃AS1 通过调控 miR⁃139⁃          RP11⁃490M8.1 ASO 及其对照（广州锐博），按照
              5p/ZEB1轴促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和上皮⁃间                        Lipofectamine 2000（Thermo Scientific 公 司 ，美 国）
              质转化（epithelial⁃mesenchymal transformation，EMT）    说明书进行质粒或 ASO 转染。RP11⁃490M8.1 表
                ；lncROPM 通过调控 PLA2G16 的 mRNA 稳定性上               达质粒及其对照质粒转染 MDA⁃MB⁃231 和 MCF⁃7
              ［6］
              调其表达，激活 PI3K/AKT、Wnt/β⁃catenin 和 Hippo/           细胞后，用嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选并用
                                                       ［7］
              YAP信号通路，进而维持乳腺癌干细胞的干性 ；ln⁃                        qRT⁃PCR 进行过表达效率的验证。
              cRNA AY343892 通过与 BRCA1 结合促进 PTEN 的               1.2.3 CCK8实验
              转录，进而抑制乳腺癌的进展 。然而，lncRNA的                              将细胞接种于96孔细胞培养板，用Opti⁃DMEM
                                         ［8］
              数目众多、作用机制复杂，其在乳腺癌发生发展中                            配制10%CCK8试剂（上海翊圣），在细胞贴壁后的0、
              的作用和机制有待进一步深入挖掘。                                  24、48、72 和 96 h 分别加入 0.1 mL CCK8 试剂，放入
                  RP11⁃490M8.1 是本课题组在 Gene Expression           37 ℃细胞培养箱中避光孵育 1~2 h，然后用酶标仪
              Omnibus（GEO）数据库中筛查发现的在乳腺癌组织                       于 450 nm 处检测吸光度值，用 GraphPad 软件进行
              中显著下调的一条lncRNA，目前尚未有关于RP11⁃                       分析并作图。
              490M8.1 在乳腺癌发生发展中的作用及机制的报                         1.2.4 克隆形成实验
              道。本研究检测 RP11⁃490M8.1 在乳腺癌组织和癌                          将细胞按 100 个/孔接种于 6 孔板中，培养 14 d
              旁组织中的表达情况，并初步研究其对乳腺癌细胞                            左右加入 5 mL 4%多聚甲醛，在 4 ℃冰箱中固定
              增殖的影响。                                            15 min 后弃去多聚甲醛，使用结晶紫染色 10~30
                                                                min，将染色液用PBS洗净后室温干燥、拍照，然后进
              1  材料和方法
                                                                行计数统计。
              1.1  材料                                           1.3  统计学方法
                  乳腺癌组织及癌旁组织取自南京医科大学第                                用 GraphPad Prism 5.0 软件和 One⁃way ANOVA
              一附属医院乳腺外科，患者未接受过局部或全身治                            检验进行实验结果分析，所有数据以均数±标准差
              疗且经病理学诊断为乳腺癌。本研究经南京医科                             （x ± s）。RP11⁃490M8.1表达水平与临床病理参数的
              大学伦理委员会批准［南医大伦理（2022）492 号］，                      关系采用χ 检验，生存分析采用Kaplan⁃Meier 检验，
                                                                          2
              标本的获取征得患者知情同意。                                    Cox多因素回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
                  人乳腺癌细胞系MCF⁃7和MDA⁃MB⁃231来源于
                                                                2  结 果
              美国 ATCC。所有细胞均使用含有 10%胎牛血清
             （FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/μL 链霉素的                 2.1  RP11⁃490M8.1在乳腺癌组织中表达下调

              DMEM（Gibco 公司，美国）培养基，并在含有 5%                           通过 GEO 数据库（GSE29431）分析了人乳腺癌
              CO2的 37 ℃细胞培养箱中进行培养。                              及癌旁组织中差异表达的lncRNA。对这些差异表达

              1.2  方法                                           的lncRNA进一步筛选发现，RP11⁃490M8.1在乳腺癌
              1.2.1 qRT⁃PCR                                     组织中表达显著下调（图 1A）。利用 Web server for
                  用 TRIzol 试剂（大连宝生物）提取乳腺癌组织、                    Coding Potential Assessing Tool 预测了RP11⁃490M8.1
              癌旁组织以及乳腺癌细胞的总RNA，将RNA按照试                          的蛋白编码能力，结果显示RP11⁃490M8.1不具有蛋
              剂商提供的说明书（Reverse Transcription Kit，南京             白编码能力（图1B）。用qRT⁃PCR检测了36对乳腺
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