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第43卷第6期               杨辰思，杨中州. TANGO2全身敲除小鼠在生理条件下正常发育和繁殖［J］.
                  2023年6月                    南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：780-785，801                     ·781 ·


                和认知障碍的脑部疾病和心脏异常                   ［1］ 。这一由        病原因，阐明其是否是导致 DiGeorge 综合征的关键
                TANGO2 双 等 位 基 因 突 变 引 起 的 疾 病 被 称 为              候选基因，本研究制备了 TANGO2 敲除的小鼠模
                TANGO2 相关疾病，是一种新发现的常染色体隐性                         型，并首次对其表型进行研究，重点关注心脏和神
                的罕见疾病     ［2-5］ 。目前已报道的TANGO2相关疾病                 经发育。
                患者有 70 余例，发病年龄范围差异较大，从婴儿期
                                                                  1  材料和方法
                到成年期均可能首次发病             ［6-9］ 。TANGO2 的缺失还
                与DiGeorge综合征有关，该综合征是由22号染色体                       1.1  材料
                11.2.7 位点的 1.5~3 Mb 杂合缺失引起的，是最常见                      TANGO2 小鼠从剑桥⁃苏大基因组资源中心
                                                                              -/-
                的染色体微缺失疾病之一，涉及30多个基因的单等                          （CAM⁃SU GRC）获得，属于C57BL/6N背景。通过在

                位基因缺失，其中包括 TANGO2            ［10-11］ 。DiGeorge 综  内含子Ⅱ中插入终止序列，使得 TANGO2 的基因转
                合征主要由从头非同源减数分裂重组事件引起，其                            录在外显子Ⅱ后终止，后面的外显子Ⅲ~Ⅸ不能进
                典型特征包括发育迟缓、圆锥动脉干心脏缺陷和面                            行正常转录，从而实现TANGO2的靶向破坏（图1）。
                部畸形   ［12-14］ 。                                       小鼠按照《南京大学小鼠福利与伦理条例》分
                    TANGO2蛋白在进化上高度保守且在生物体内                        笼饲养，12 h/12 h 明暗交替，自由进食和饮水，环境
                普遍表达，但目前 TANGO2 蛋白的细胞定位和具体                        温度 25 ℃，湿度 55%~60%。南京大学动物保护和

                功能仍然不清楚。生物信息学预测小鼠 TANGO2                          使用委员会（IACUC）批准了本研究中使用的所有动
                的蛋白产物（T10）的氨基酸序列中可能存在线粒体                          物处理程序。
                靶向基序    ［15］ 。在转染 GFP⁃融合蛋白的 NIH⁃3T3 细
                                                                   2       FRT        loxP    FRT loxP  3 loxP  4 5  9
                胞中，T10与线粒体共定位          ［15］ 。然而，在表达GFP⁃融                                                     …
                                                                                lacZ       neo               …
                合蛋白的HeLa细胞中，TANGO2是否与线粒体标志                                  SA       pA       pA
                物共定位，在两项不同的研究中观察到了相反的结                                     图1  小鼠TANGO2基因的敲除策略
                                                                  Figure 1  The strategy of targeted disruption of the mouse
                果 ［16］ 。由于目前没有开发出适用于免疫荧光成像
                的 TANGO2 抗体，所以还无法确定 TANGO2 在细胞                             TANGO2 gene
                中的明确定位。                                           1.2  方法
                    已有研究表明 TANGO2 在高尔基体转运和线                       1.2.1 基因型鉴定
                粒体功能中发挥双重作用。在果蝇 S2 细胞中，                               使用从小鼠尾部提取的 gDNA，通过 PCR 分析
                TANGO2 蛋白缺失会导致高尔基体膜与内质网融                          小鼠的基因型。位于外显子Ⅱ的引物（TANGO2⁃F：
                合 。在TANGO2缺失患者的成纤维细胞中，没有观                         5′⁃AAAGTACAGGTGCCCACAGATACCA⁃3′）与位于
                  ［1］
                                                           ［5］
                察到高尔基体融合或高尔基体体积减少的现象 。                            插 入 的 转 录 终 止 序 列 下 游 的 内 含 子 Ⅱ 的 引 物
                TANGO2突变患者的成纤维细胞的膜运输分析结果                         （TANGO2⁃WT⁃R：5′⁃GGAAAAGAAAGTTCAAGG⁃
                显示，内质网和高尔基体之间的货物运输有明显延                            GAAGCCA⁃3′）一起使用，该引物从野生型（WT）等
                迟，而且补充 TANGO2 蛋白可以挽救这一过程                  ［16］ 。  位基因中扩增出487 bp的条带，而从敲除的等位基
                另有研究表明，TANGO2 缺失患者成纤维细胞的蛋                         因中没有扩增出条带。TANGO2⁃F与位于插入的转
                白质组学分析发现了线粒体脂肪酸氧化、质膜、内                            录终止序列的引物（TANGO2⁃KO⁃R：5′⁃AACATA⁃
                质网⁃高尔基体网络和分泌途径的显著变化                    ［17］ 。据    AAGTGACCCTCCCAACAGC ⁃3′）一起用于从敲除的
                报道，TANGO2 缺失患者细胞中的超氧化物产生增                         等位基因中扩增 328 bp 的条带。PCR 程序为 95 ℃
                加，而氧消耗速率减少          ［18］ 。TANGO2 缺失患者的成           3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，
                纤维细胞中也观察到了线粒体形态的变化                     ［16］ 。但    35 个循环；最后72 ℃ 8 min。
                也有研究倾向于认为 TANGO2 缺失患者中观察到                         1.2.2 荧光实时定量PCR反应分析
                的线粒体损伤是一种继发伤害 。                                       分离 WT 和 TANGO2 新生小鼠的心脏和大脑
                                           ［19］
                                                                                         -/-
                    TANGO2的研究主要集中在人类患者和体外细                        组织，在液氮中速冻，并在-80 ℃下储存。使用研磨
                胞实验上，目前还没有该基因在哺乳动物体内的相                            机将样品在冰上匀浆，使用 FastPure 细胞/组织总
                关研究，而且 TANGO2 相关疾病的致病机制还不清                        RNA提取试剂盒（RC112⁃01，Vazyme公司，美国）提取
                楚。为了研究 TANGO2 的生理功能及其缺失的致                         总RNA。使用HiScript Ⅲ逆转录酶试剂盒（R302⁃01，
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