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第43卷第7期            刘雪昂，时 坚，胡       冉，等. 糖基化基因B4GALT5在胰腺癌恶性进展中的作用［J］.
                  2023年7月                   南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：917-926，944                     ·919 ·


                析，Kaplan⁃Meier 曲线又称生存曲线，主要分析与评                    1.2.10  划痕实验
                估单一因素对患者生存期的影响。                                       铺板前用记号笔在 6 孔板背面划 2 条横线，线
                1.2.5  细胞培养                                       间距为0.5~1.0 cm，横穿过孔。每孔加入5×10 个细
                                                                                                           5
                    人 胰 腺 癌 细 胞 系（CFPAC⁃1、MIA PaCa⁃2、             胞。24 h后用枪头垂直于背后的横线划痕。PBS洗
                BxPC⁃3、PANC⁃1）和正常人的胰腺导管上皮细胞系                      3 次去除漂浮的细胞，加入无血清培养基，放入
               （HPNE）均购于上海细胞库。小鼠胰腺癌细胞系                            37 ℃、5% CO2 培养箱培养。按 0 h、24 h 时间点取
                Panc02 购于北京国家实验细胞资源共享服务平                          样，拍照。使用 Image J 软件测量最开始（0 h）的划
                台。细胞系均使用含有 10%胎牛血清的 DMEM 培                        痕面积和24 h的伤口面积，计算24 h的伤口划痕百
                养基，在5% CO2培养箱中37 ℃培养。                             分比=24 h的伤口面积/0 h的划痕面积×100%。
                1.2.6  定量PCR                                      1.2.11  Transwell侵袭实验
                    使用 TRIzol 试剂抽提细胞和研磨后组织中的                          用 1∶5 稀释的基质胶包被上室底部，放置于

                总 RNA。接下来，使用 1 μg 总 RNA 和 TRUEscript              37 ℃培养箱约 30 min。用无血清的 DMEM 制备细
                RT 试剂盒在 20 μL 的最终体积中进行逆转录。采                       胞悬液，细胞浓度调整为2×10 个/mL。在上室加入
                                                                                             5
                用 2×SYBR Green Master Mix和终体积10 μL的体系             200 μL 细胞悬液，在下室加入 500 μL 含 10% FBS

                进行定量 PCR。采用 2         - ΔΔCt  法计算相对基因表达           的培养基，在 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h。
                量 。 每 次 实 验 均 设 置 3 个 复 孔 ，共 重 复 3 次 。            用棉签轻轻擦拭上室的细胞，用 4%多聚甲醛固

                B4GALT5 引 物 序 列 如 下 ：上 游 5′ ⁃ GATCCGGGA⁃          定 10 min，然后用 0.1%结晶紫染色 5~10 min，用
                CAACGTGA ⁃ GAAC ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ TTCAGGGCAGG⁃       PBS 洗涤 3 次，在倒置显微镜下随机选择 10 个高
                TATGGTTTGC⁃3′。GAPDH 引物序列如下：上游 5′⁃                 倍视野（×200）进行细胞计数。
                ACGGGAAGC ⁃ TTGTCATCAAT ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ TG⁃        1.3  统计学方法
                GACTCCACGACGTACTCA⁃3′。                                所有数据统计分析和可视化均在R4.2.1版本及
                1.2.7  Western blot                               GraphPad Prism 7 中进行，每个实验独立重复 3 次，
                    使用 RIPA 缓冲液分离总蛋白，然后用 BCA 蛋                    数据以均数±标准差（x ± s）表示，pROC［1.18.0］用于
                白分析试剂盒定量。用 10%SDS⁃PAGE 胶电泳，恒                      受试者工作特征（receiver operating characteristic，
                压 100 V 持续 1 h。接着用 PVDF 膜恒流 0.4 A 湿转              ROC）曲线分析，生存分析采用Kaplan⁃Meier 法并进
                40 min。用 5%脱脂牛奶封闭 2 h 后，使用稀释后的                    行 log⁃rank 检验，两组间比较采用 t 检验，多组间比
                一抗在 4 ℃下孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶                          较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异具有统计
                标记的二抗在室温下孵育 2 h。洗涤 3 次后，使用                        学意义。
                ECL 化学发光试剂检测。使用 Image J 软件对电泳                     2 结    果
                条带进行灰度扫描，同时进行半定量分析。
                1.2.8  质粒转染                                       2.1  胰腺癌预后相关糖基化基因的筛选
                    取无酶 1.5 mL EP 管，加入对应比例的 Lipo⁃                     基于 TCGA⁃GTEx 联合数据库中 178 例胰腺癌
                fectamine 3000 转染试剂和不含抗生素的 DMEM 培                 患者数据（表 1）和 169 例正常组织数据，在糖基化
                养基，吹打混匀静置5 min；另取1.5 mL EP管，加入                    基因集中共筛选出 66 个 DE⁃GRG，包含 20 个下调
                质粒，再加入不含抗生素的 DMEM 培养基，吹打混                         基因和 46 个上调基因，绘制热图将其进行可视化
                匀静置 5 min。最后将两个 EP 管中的试剂混合均                      （图 1A）。为了进一步鉴定与预后相关的DE⁃GRG，
                匀，静置15 min 后将Lipofectamine 3000和质粒混合              根据 TCGA 数据库中的转录本信息和临床参数，
                溶液缓慢旋转加入细胞培养皿中。24 h 后换液，                          使 用 单 因 素 Cox 分 析 得 到 20 个 与 预 后 相 关 的
                48~72 h检验转染效率。                                    DE⁃GRG，其中14个为危险性因素，6个为保护性因
                1.2.9  CCK⁃8实验检测细胞的增殖水平                           素（图 1B），其中，HR 最大的基因是糖基转移酶
                    将转染后的胰腺癌细胞接种于96孔板，37 ℃培                       B4GALT5（HR=21.372，P < 0.05）。
                养 48 h 后，替换为 100 μL/孔 10%的 CCK⁃8 溶液，放                 进一步对20个预后相关的DE⁃GRG 进行了GO
                置培养箱避光孵育 1 h，酶标仪测定 450 nm 处的吸                     和KEGG富集分析。在GO分子功能中，DE⁃GRG主
                光度值。                                              要富集在各类糖基转移酶活性领域 GO 生物过程
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