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第43卷第8期      薛佳佳，王艺颖，胡成秀，等. 穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡［J］.
                  2023年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1076-1084                      ·1077 ·


                    内皮细胞（endothelial cell，EC）是位于血管壁表             （BioVision 公司，美国），凋亡抑制蛋白 1（cellular in⁃
                面一层连续的扁平细胞，充当着血流与血管壁之间                            hibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）siRNA、IRF2 siRNA
                的结构屏障，在血管稳态的维持上起着重要作用。                           （Santa Cruz Biotechnology，美国），BCA 蛋白浓度测
                由于所处位置的特殊性，EC经常受到一些危险因素                           定试剂盒（北京碧云天生物技术有限公司），Lipo⁃
                的刺激，如肿瘤坏死因子（TNF⁃α）、氧化低密度脂蛋                        factamine 2000、Protein Marker（Thermo 公司，美国），
                白（oxLDL）等炎症因子或血流应切力，均可打破EC                        MVP抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国），cIAP1抗
                增殖与死亡动态平衡，导致 EC 功能失调。EC 过度                        体、cIAP2 抗体、cleaved Caspase 3 抗体（Cell Signal⁃
                死亡后，内皮完整性不复存在，血管壁结构和通透性                           ing Technology，美国），GAPDH 抗体、α⁃Tubulin抗体
                显著改变，血流动力学改变，可促进oxLDL以及单核                        （Proteintech 公司，中国），β⁃actin 抗体（上海 Abmart

                细胞黏附并浸润到血管壁，导致动脉粥样硬化（ath⁃                         公司）。MVP 敲降和过表达慢病毒（shRNA⁃MVP 和
                erosclerosis，AS）斑块及其他血管性疾病        ［1-2］ 。         Lenti⁃MVP）以及空载体病毒由南京医科大学陈琪教
                    穹窿体是一种在真核生物体内高度保守的核                           授课题组赠送。
                糖核蛋白复合物，许多研究表明穹窿体参与广泛的                            1.2  方法
                细胞功能，包括核质运输、药物耐受、感染免疫、细                           1.2.1 细胞培养及处理
                胞信号传导、mRNA定位和核孔装配等                ［3-4］ 。穹窿主          HAEC 使用含 10%FBS 的 EC 培养基 EGM⁃2 重
                体蛋白（major vault protein，MVP）是细胞内构成穹               悬，铺到以明胶包被的培养板内，置于37 ℃、5% CO2
                窿体的主要成分之一。MVP 因最早在肺耐药相关                           培养箱中培养。待细胞生长到培养板表面约 80%
                研究中被鉴定，因此又称为肺耐药相关蛋白（lung                          时，以Z⁃VAD⁃FMK（50 μmol/L）或Nec⁃1（50 μmol/L）
                resistant associated protein，LRP）。 后 续 研 究 发 现    预处理 4 h，加入人 TNF⁃α（10 ng/mL）共孵育 8 h 后，
                MVP 与肿瘤细胞的增殖凋亡密切相关，通过 PI3K⁃                       收集细胞进行下一步分析。
                                                     ［5］
                AKT、Ras/Raf/MEK信号通路调控细胞活性 。近年                     1.2.2 慢病毒感染及细胞转染
                来发现，MVP 可调控血管平滑肌细胞增殖活性 ，                              待 HAEC 生长到培养板表面约 80%时，直接加
                                                           ［6］
                巨噬细胞中的MVP对动脉粥样硬化、肥胖有抑制作                           入慢病毒感染细胞以敲降或过表达MVP。siRNA则
                用 ，而 EC 中的 MVP 相关研究仍未见报道。血管                       以 Lipofactamine 2000 转染 HAEC：按照说明书配制
                  ［7］
                壁稳态在 AS 等心血管疾病进展中至关重要，探究                          转染液和 siRNA 稀释液，两者混匀后室温下静置
                MVP 在人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial            20 min，加入到已换液的细胞培养板中。培养 72 h
                cell，HAEC）中发挥的作用及机制，可为心血管疾病                       后，进行下一步处理与分析。
                的防治提供思路。                                          1.2.3 CCK⁃8试验
                                                                      在 96 孔板中每孔加入 100 μL 的 HAEC 细胞悬
                1  材料和方法
                                                                  液，密度约5 000个细胞/孔。37 ℃培养箱中培养24 h
                1.1  材料                                           后，感染慢病毒。72 h 后，以 TNF⁃α（10 ng/mL）处理
                    HAEC（Catalog No. PCS ⁃ 100 ⁃ 011，Lot No.      8 h。贴壁加入 10 μL CCK⁃8 溶液，在 37 ℃孵育 1 h
                63233442，Manassas，VA）购自美国模式培养物集存                  后，用酶标仪（ELx800）检测 450 nm 与 600 nm 的吸
                库（American Type Culture Collection，ATCC）。 EC      光度值，计算两者的差值。以已知数量细胞绘制细
                培养基EGM⁃2（Lonza公司，瑞士），胎牛血清FBS、胰                    胞活性曲线，计算细胞增殖活力。
                蛋白酶（Gibco公司，美国），青/链霉素混合液（双抗）                      1.2.4 流式细胞术
               （Thermo 公司，美国），rh⁃TNF⁃α（R&D Systems，美                  Annexin V 结合实验和 Caspase 3、Caspase 8 活
                国），脂质体转染试剂盒（Invitrogen 公司，美国），                    性实验均按试剂盒说明书要求操作。使用不含
                TRIzol 试剂（TaKaRa 公司，日本），CCK⁃8 试剂检测                EDTA 的胰酶消化 HAEC，以培养液终止消化后，
                盒、Z⁃VAD⁃FMK（Z⁃VAD）、Necrostatin⁃1（Nec⁃1）           400 g离心5 min，收集细胞。PBS洗涤细胞后，加入
               （Med Chem Express 公司，美国），PCR 逆转录试剂                 FITC⁃Annexin V/PI 染料，或 Caspase 3、Caspase 8 底
                盒、PCR 荧光定量试剂盒（上海翊圣生物技术公                           物荧光染料避光染色后，以 FACSCalibur 流式细胞
                司），Annexin V⁃FITC/propidium iodide（PI）检测试剂        仪（BD Biosciences，美国）进行检测，以 FlowJo 软件
                盒（南京Fcmacs公司），Caspase 3、8活性检测试剂盒                  进行数据分析。
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