Page 44 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第8期
·1078 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年8月

1.2.5 RNA提取和荧光定量PCR （HRP）标记的二抗孵育 2 h。使用增强型化学发光
使用 TRIzol 试剂分离提取总 RNA。使用逆转 试剂（ECL）和数字凝胶图像分析系统检测结果。使
录试剂盒将1 μg总核糖核酸逆转录成cDNA。逆转 用 Image J 软件定量蛋白质表达水平。本研究展示
录温度参数如下：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 了至少3个独立实验的代表性图像。
5 min。使用荧光定量试剂盒进行实时聚合酶链反 1.3 统计学方法
应，热循环参数如下：在 95 ℃下初始变性 5 min； 所得数据采用 GraphPad Prism 软件作图，数据
40 个扩增循环：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s；最后在72 ℃延 以均数±标准差（x ± s）表示。两组数据的差异通过t

伸20 s。使用2 -△△Ct 方法（其中Ct是循环阈值）将相关 检验进行分析，多组之间的比较采用单因素方差分
基因表达量与GAPDH mRNA水平做标准化计算，每 析。所有实验至少独立重复3次，P < 0.05为差异有
个处理组做3个复孔。MVP、IRF2引物由南京擎科公 统计学意义。
司合成，其他引物均由上海生工公司合成（表1）。
2 结 果
表1 荧光定量PCR引物序列 MVP促进HAEC增殖，抑制HAEC死亡
Table 1 Primer sequences for real⁃time PCR 2.1
为探究MVP对HAEC增殖活性的影响，使用慢
基因名称 引物序列（5′→3′）
病毒在 HAEC 中敲降 MVP。荧光定量 PCR 和蛋白
Caspase 8 F: AGGGACAGGAATGGAACAC
Western blot 均验证敲降效率（P < 0.01，图 1A、B）。
R: TGTCAGCTCATAGATGGGG
cIAP1（BIRC2） F: TGTGGTGGGAAGCTCAGT CCK⁃8 法检测 MVP 对 HAEC 增殖的影响，结果显
R: GACATCATCATTGCGACCC 示，与对照组相比，敲降 MVP 显著降低 HAEC 基底
cIAP2（BIRC3） F: AGGTGTTGGGAATCTGG 增殖活性（P < 0.01，图 1C）。TNF⁃α是促细胞死亡
R: TGGGCTGTCTGATGTG 的炎性细胞因子，10 ng/mL的TNF⁃α处理8 h后，降低
CYLD F: AGGGTGAGGATGGTTCT
了 HAEC 增殖水平。在 MVP 被敲降的 HAEC 中，其
R: CGAGAGTTGGAAGGCA
增殖进一步降低。与该结果相一致，流式细胞术检测
FADD F: GCCTAGACCTCTTCTCC
PI阳性细胞，结果显示，敲降MVP显著增加基底以及
R: AGCCAGCCTTCTCCA
TNF⁃α诱导的细胞死亡（P < 0.05，图1D、E）。
FLIP（CFLAR） F: TCTGGTTTTGCGGAGC
在 HAEC 中 过 表 达 MVP，荧 光 定 量 PCR 和
R: GCAGGCAGTCAACTTC
Western blot 均验证过表达效率（P < 0.01，图 1F、
RIP1 F: AGTAATCCCCAACCCTC
R: GGGTTCTGTGGAAACAC G）。在基底或 TNF⁃α处理时，MVP 过表达均促进
TRADD F: ATCTGAAGTGCGGCTC HAEC 增殖（图 1H）、抑制 HAEC 死亡（图 1I、J）。以
R: TGCGCCATTTGAGACC 上结果证实，MVP对HAEC具有保护作用。
TRAF2 F: TACTGCTCCTTCTGCCT
2.2 MVP抑制TNF⁃α诱导的HAEC凋亡
R: GGACATTCGGTCAGCAT
使用两种抑制剂评估 MVP 对 HAEC 死亡的调
TNFR1（TNFRSF1A） F: AACCCTCAACTGTCACC
控：①Z⁃VAD⁃FMK（简写 Z⁃VAD），一种广谱的半胱
R: ACCAGTCCAATAACCCC
氨酸蛋白酶（Caspase）抑制剂，阻断凋亡通路；②
GAPDH F: GAGTCAACGGATTTGGTCGT
R: GGTGCCATGGAATTTGCCAT Necrostatin⁃1（简写 Nec⁃1），是受体相互作用蛋白 1
（receptor⁃interacting protein 1，RIP1）的激酶抑制剂，
1.2.6 蛋白质免疫印迹（Western blot） 被认为是坏死性凋亡的阻断剂。结果显示，Z⁃VAD
在冰上以蛋白裂解液裂解 HAEC 细胞，提取总 可以显著逆转 MVP 敲降引起的 HAEC 死亡（P <
蛋白。经 BCA 试剂盒测量蛋白浓度后，取含等量 0.01，图 2A、B），而使用 Nec⁃1 对敲降 MVP 引起的
（20~30 μg）蛋白质的裂解液，于 95 ℃加热 5 min。 HAEC死亡无明显影响（图2C、D），提示细胞凋亡参
以 SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）分离样品中的 与了MVP缺失导致的HAEC死亡。
蛋白质，转到0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）膜。将膜 以流式细胞术检测 Annexin V 结合与 Caspase 3
置于室温下以5%脱脂奶粉溶液封闭2 h后，加入相 活性，以 Western blot 检测 Caspase 3 剪切体，均证实
应的一抗于 4 ℃孵育过夜。第 2 天，用 TBST（含 敲降 MVP 增加 TNF⁃α诱导的 HAEC 凋亡（P < 0.01，
0.1%吐温 20）洗涤后，在室温下与辣根过氧化物酶 图 2E~G），过表达 MVP 则完全相反（P < 0.05，图