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第44卷第11期             季   明，乔汉连，马梦青，等. 低谷蛋白大米延缓慢性肾脏病小鼠肾功能进展［J］.
                 2024年11月                  南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1491-1498，1509                   ·1493 ·


                1.2  方法                                           于第8周和16周分别收集小鼠尿液，将小鼠转移至
                1.2.1 实验小鼠分组                                      代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液后测定尿量，混
                    6~8 周龄无特定病原体（specific pathogen free，          匀后取1 mL，2 000 r/min、4 ℃离心（离心半径10 cm）
                SPF）雄性BALB/c 小鼠购自南京医科大学实验动物                       10 min，去除沉渣后留取上清液于-20 ℃冰箱保存。
                中心，体重23~25 g，共96只。采用随机数字法分为                       参照试剂盒说明书操作流程，测定 mAlb/Cr、24 h
                CKD、CKD⁃Control 组，以及DKD、DKD⁃Control 组，每           UPro等指标。
                组又分为LG大米喂养组（分别为LG⁃CKD、LG⁃CKD⁃                     1.2.6 Masson染色
                Control 和 LG⁃DKD、LG⁃DKD⁃Control）和 NG 大米喂              在造模成功后，分别喂养小鼠 LG 大米和 NG

                养组（NG⁃CKD、NG⁃CKD⁃Control 和 NG⁃DKD、NG⁃             大米 16 周，异氟烷吸入麻醉小鼠后颈椎脱位法处
                DKD⁃Control），每组12只。小鼠饲养于SPF屏障中，                   死。肾组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二
                适应性饲养 1 周，保持恒温 25 ℃，相对湿度 70%的                     甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm切片，Masson、HE染色后
                环境，12 h 光/暗循环，自由摄入大米和水。本研究                        光镜下观察肾组织病理学变化               ［10］ 。肾间质纤维化
                符合3R原则，已通过南京医科大学动物伦理委员会                           评分依据 Masson 染色，按阳性区域面积评分：0 分，
                批准（IACUC⁃2311001）。                                无；1分，<25%；2分，≥25%~50%；3分，≥50%~75%；
                1.2.2 阿霉素诱导的CKD小鼠模型的构建                            4分，≥75%。200倍光学显微镜下每张切片随机观察
                    用随机数字法将 SPF 级 BALB/c 小鼠分为对照                   10个不重叠视野，取平均值作为肾小管损伤的指标。
                组（CKD⁃Control）和 CKD 组。CKD 组小鼠尾静脉单                 1.2.7 转录组学分析
                次注射阿霉素（10 mg/kg），CKD⁃Control 组小鼠尾静                    喂养16周处死小鼠后取出肾脏，将左肾立即浸
                脉单次注射同体积生理盐水。造模8周检查24 h尿                          入RNAlater溶液中，4 ℃过夜后转至-80 ℃保存。使
                蛋白（24⁃hour urinary protein，24 h UPro）定量，CKD 组     用RNeasy Mini Kit 提取总 RNA。RNA 完整性通过
                                                        ［7］
                与CKD⁃Control组有显著差异，且差异≥50 mg 确认                   Agilent 2100生物分析仪评估，仅RIN值>8的样本用
                为模型成功。                                            于 后 续 实 验 。 利 用 NEBNext Ultra Ⅱ Directional
                1.2.3 DKD小鼠模型的构建                                  RNA Library Prep Kit构建文库。在Illumina NovaSeq
                    通过高脂高糖饲料喂养小鼠 4 周，再连续 5 d                      6000平台上进行150 bp双端测序，每个样本产生约
                腹腔注射 55 mg/kg 链脲佐菌素建立小鼠 DKD 模                     40 million读段。原始数据经FastQC质控和Trimmo⁃
                型 ；另取24只小鼠作为对照组（DKD⁃Control），以基                   matic 过滤后，使用 STAR 将清洁读段比对到小鼠参
                  ［8］
                础饲料喂养，同时腹腔注射相应剂量的柠檬酸钠                             考基因组（GRCm39）。采用 FeatureCount 进行基因
                缓冲液。注射结束1周后测量小鼠随机血糖和24 h                          表达定量。差异表达分析使用 DESeq2 进行，设置
                UPro，以血糖≥16.7 mmol/L，且24 h UPro≥30 mg/dL为         标准为|log2FoldChange| ≥ 1 且调整后 P 值（FDR）<
                DKD小鼠模型建立成功的标准 。                                  0.05。使用 clusterProfiler 进行 KEGG 富集分析。对
                                           ［9］
                1.2.4 血液学相关指标的检测                                  差异表达基因进行 GO富集分析，对其功能进行描述
                    在造模成功后，分别喂养LG大米和NG大米，每                       （结合 GO注释结果）。根据GO分析的结果结合生物
                周测量小鼠体重，第16周后眼眶取血，3 000 r/min、                    学意义挑选用于后续研究的基因。利用 KEGG数据
                4 ℃离心 10 min（离心半径 10 cm），分离血清，于                   库对差异蛋白编码基因进行Pathway分析。
                -18 ℃冰箱保存待测。血常规检测使用全自动血细                          1.3  统计学方法
                胞分析仪。参照试剂盒说明书操作，检测血尿素氮                                使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态
               （blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（serum creatinine，     分布的数据用均数±标准差（x ± s）表示，偏态分布数

                sCr）、胱抑素（cystatin C，Cys C）、空腹血糖（fasting           据则以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，两独
                blood glucose，FBG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、    立样本的比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学

                甘油三酯（triglyceride，TG）、视黄醇结合蛋白（retinol             意义。
                binding protein，RBP）等指标。
                                                                  2 结 果
                1.2.5  尿微量白蛋白/尿肌酐比值（urinary albumin⁃
                to⁃creatinine ratio，mAlb/Cr）、24 h UPro定量检测        2.1 各组小鼠摄食和体重变化
                    在造模成功后，分别喂养 LG 大米和 NG 大米，                         每日记录每只小鼠摄食量，汇总分析后可见同
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