Page 18 - 南京医科大学自然版
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第44卷第4期
               ·456 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年4月


              mice by enhancing the antioxidant capacity.
             ［Key words］ osteoporosis；p53；1，25（OH） 2D3；oxidative stress
                                                                         ［J Nanjing Med Univ，2024，44（04）：455⁃461，545］





                  骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种全身性骨骼                 所致的骨质疏松。
              疾病，以骨量减少、骨组织的微结构恶化、易引发脆性
                                                                1  材料和方法
              骨折为主要病理特征 。骨质疏松是一种衰老相关
                                 ［1］
              的慢性疾病，常见于中老年患者。全球骨质疏松患病                           1.1  材料
              率约为18.3% ，且脆性骨折发生率随年龄增长明显                         1.1.1 动物
                          ［2］
              增加  ［3-4］ 。因此，深入研究骨质疏松发生发展的分子机                         本研究所用1α（OH）ase 小鼠由加拿大麦吉尔
                                                                                          +/-
              制对其早期诊断及防治具有重要意义。                                 大学引进，亲代p53 小鼠通过南京大学模式动物中
                                                                                 +/-
                  在肝脏25⁃羟化酶的作用下，维生素D原被转化                        心代为从美国 Jackson lab 引进。成年 1α（OH）ase           +/-
              成 25（OH）D3，后通过肾脏 1α⁃羟化酶［1α（OH）ase］                小鼠与 p53 小鼠雌雄合笼，获得1α（OH）ase p53               +/-
                                                                          +/-
                                                                                                        +/-
              转化成活性维生素D［1，25（OH） 2D3］，再与维生素D                    双杂基因型小鼠，再将双杂基因型小鼠雌雄合笼，获
              受体（vitamin D receptor，VDR）结合发挥其功能 。               得 5 组同窝 WT、p53 、1α（OH）ase 及 1α（OH）ase        -/-
                                                         ［5］
                                                                                  +/-
                                                                                               -/-
              维生素D能促进肠道对钙、磷的吸收，维持体内钙磷                           p53 小鼠，雌雄不限，3 周龄分笼后，给予高钙高磷
                                                                    +/-
              平衡，对骨骼矿化和骨量维持有重要意义 。研究显                           饮食（含 2%钙、1.25%磷、20%乳糖）喂养至 10 周
                                                  ［6］
              示，1α（OH）ase 及VDR 小鼠均表现佝偻病、骨质疏                     龄。动物使用均严格遵照南京医科大学实验动物
                           -/-
                                   -/-
              松等早衰表型，补充内源性或外源性1，25（OH） 2D3均                     管理规范进行（IACUC：1802007）。
              能促进成骨细胞骨形成           ［7-8］ ，然而，1，25（OH） 2D3缺失     1.1.2 试剂
              导致骨质疏松发生发展的分子机制有待进一步研究。                                兔抗Ι型胶原（collagen typeⅠ，Col⁃Ⅰ）抗体（Chem⁃
                  p53⁃p21 是介导细胞衰老的经典通路之一，                       icon 公司，美国），兔抗超氧化物歧化酶（superoxide
              DNA 损伤激活 p53 信号通路在细胞衰老中起重要                        dismutase，SOD）1 抗体（Abcam 公司，美国），2’，7’⁃
                  ［9］
              作用 。p53 敲除（p53 ）小鼠的成骨细胞衰老减                        二氯二氢荧光素二乙酯（DCF⁃DA，Sigma 公司，美
                                   -/-
              少，分化加速，骨密度增加            ［10］ 。但 p53 作为重要的         国）。
              抑癌基因，p53 小鼠仅能存活 6 个月              ［11］ 。研究表       1.2  方法
                           -/-
              明，氧化应激反应抑制骨形成，导致骨损伤，而抗                            1.2.1 组织取材及切片
              氧化剂能够促进骨髓间充质干细胞（bone marrow                            采用0.3%的戊巴比妥钠溶液（0.2 mL/10 g体重）
              mesenchymal stem cell，BM⁃MSC）向 成 骨 细 胞 分          腹腔注射麻醉小鼠后，经心脏穿刺取外周血，静置4 h
              化，抑制破骨细胞活性，从而预防骨质疏松的发                             后离心分离血清做血清生化检测。取股骨和胫骨，
              生 ［12-13］ 。也有研究发现，1，25（OH） 2D3 通过 VDR             使用 PLP（2%副醛，75 mmol/L 赖氨酸，10 mmol/L 过
              介导转录调控核因子 E2 相关因子（nuclear factor                  碘酸钠）固定液固定，骨组织经过脱钙、脱水、浸蜡
              erythroid⁃derived factor 2⁃related factor，Nrf2）的基因  及石蜡包埋后切片，片厚5 μm。同时取新鲜胫骨冻
              转录，增强其下游抗氧化酶的表达，从而发挥抗氧                            存，用于提取蛋白做Western blot检测。
              化剂的作用     ［14］ 。                                  1.2.2 X射线摄影、micro CT扫描及三维重建分析
                                                                     取各组小鼠，解剖分离胫骨或股骨，PLP 固定
                  本研究通过建立p53半剂量缺失伴1，25（OH） 2D3
              缺乏［1α（OH）ase p53 ］的小鼠模型，给予高钙高                     后，先进行 X 射线摄影，再进行 micro⁃CT 扫描，扫描
                                  +/-
                              -/-
              磷饮食，利用X线、CT、组织病理学和分子生物学等                          后分别利用 NRecon、Dataviewer、CTan、ANT 软件进
              方法，比较它们与同窝野生型（wild type，WT）小鼠、                    行三维重建分析。
              p53 半剂量缺失杂合子（p53 ）小鼠和 1α羟化酶基                      1.2.3 组织化学和免疫组织化学染色
                                       +/-
              因敲除［1α（OH）ase ］小鼠的长骨表型差异以及氧                            石蜡切片经常规脱蜡水化，参照参考文献［15］
                                -/-
              化应激等相关指标的表达变化，探索 p53 半剂量缺                         进行苏木素⁃伊红（hematoxylin and eosin，HE）、总胶
              失能否通过增强抗氧化能力纠正活性维生素D缺乏                            原（total collagen，T⁃col）、碱性磷酸酶（alkaline phos⁃
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