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第44卷第4期 张 维，倪进荣，周 俊，等. p53半剂量缺失纠正1，25（OH） 2D3缺乏小鼠的骨质疏松［J］.
2024年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：455-461，545 ·457 ·

phatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate⁃resis⁃ 后，加入特异性二抗，室温条件下孵育60 min。洗膜
tant acid phosphatase，TRAP）染色和Col⁃Ⅰ免疫组织 后，滴加ECL混合液，自动成像仪曝光，保存显影图
［16］
化学染色 。 像。采用Image Pro Plus 6.0软件分析图像。
1.2.4 ROS流式细胞仪检测 1.3 统计学方法
小鼠麻醉后，取股骨，减去股骨两端抽出骨髓， 采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析及
经过 300 目筛网获得单细胞悬液，加预冷的 PBS 将 作图。各组计量结果以均数±标准差（x ± s）表示，采
细胞浓度调整为1×10 个/mL。取1 mL单细胞悬液， 用t检验和单因素方差（one⁃way ANOVA）进行分析，
6
加5 μL DCF⁃DA混匀，37 ℃孵育30 min，PBS清洗多 P < 0.05为差异有统计学意义。
余的染液后通过流式仪检测细胞内荧光探针的平
2 结 果
均荧光强度。
1.2.5 Western blot实验 2.1 p53半剂量缺失对1，25（OH） 2D3缺乏小鼠血清
参照参考文献［17］提取骨组织蛋白后进行 指标的影响
Western blot 实验和结果分析。骨组织按质量/体 检测了 10 周龄高钙磷饮食同窝 WT、p53 、
+/-
积约为 1∶25加入RIPA裂解，剪碎、匀浆后，于冰盒 1α（OH）ase 和 1α（OH）ase p53 小鼠血清钙、磷、
-/-
+/-
-/-
中静置30 min。裂解液13 000 r/min 4 ℃离心15 min， 1，25（OH） 2D3 和甲状旁腺素（parathyroid hormone，
取上清使用 BCA 法进行定量。蛋白样 100 ℃水浴 PTH）水平的变化。结果发现：给予高钙磷饮食喂养
10 min，-80 ℃冰箱保存。每组蛋白加样 20 μg 至 后，各组小鼠血清钙（图1A）、磷（图1B）和PTH（图1C）
10%SDS⁃PAGE 胶，110 V 恒压电泳 2 h。300 mA 恒 水平差异无统计学意义。p53 小鼠与WT小鼠的血清
+/-
流转膜 90 min，使蛋白湿转至硝酸纤维素膜。用含 1，25（OH） 2D3水平差异无统计学意义，而1α（OH）ase -/-
5%脱脂奶粉PBST于37 ℃条件下封闭60 min。加入 小鼠和1α（OH）ase p53 小鼠均检测不到1，25（OH）D3
-/-
+/-
2
适量一抗［兔抗β actin抗体（1∶1 000）、兔抗SOD1抗 （图 1D），以上实验结果提示 p53 半剂量缺失改善
体（1∶1 000）］在 4 ℃条件下孵育过夜。5%PBST洗涤 1，25（OH） 2D3缺乏小鼠的骨质疏松与钙磷变化无关。
A B C D
4 4 50 100
（mmol/L） 3 2 （mmol/L） 3 2 （pg/mL） 40 2D3 （pg/mL） 80

30
60
Calcium 1 Phosphorus 1 PTH 20 1，（OH） 25 40

20
10
*** ***
0 0 0 0
WT p53 +/- ase -/- -/- p53 +/- WT p53 +/- ase -/- -/- p53 +/- WT p53 +/- ase -/- -/- p53 +/- WT p53 +/- ase -/- -/- p53 +/-
（OH）
（OH）
（OH）
（OH）
1α （OH） ase 1α （OH） ase 1α （OH） ase 1α （OH） ase
1α 1α 1α 1α
A：Statistical diagram of serum calcium levels in four group mice. B：Statistical diagram of serum phosphorus levels in four group mice. C：Statistical
***
diagram of PTH levels in four group mice. D：Statistical diagram of 1，25（OH） 2D3 levels in four group mice. Compared with the WT group， P < 0.001
（n=5）.
图1 p53半剂量缺失对1，25（OH）D3缺乏小鼠血清钙、磷、PTH和1，25（OH）D3水平的影响
2
2
Figure 1 Effects of half⁃dose deletion of p53 on mouse serum levels of calcium，phosphorus，PTH and 1，25（OH）D3 in
2
1，25（OH）D3 deficient mice
2
+/-
-/-
-/-
+/-
2.2 p53半剂量缺失对1，25（OH） 2D3缺乏小鼠骨矿 p53 、1α（OH）ase 和1α（OH）ase p53 小鼠骨矿化
化和骨容量的影响 程度与骨容量的变化。结果显示：与WT小鼠相比，
为了明确p53半剂量缺失能否改善活性维生素 p53 小鼠骨矿化和骨容量增加，1α（OH）ase 小鼠
+/-
-/-
D 缺乏引起的骨骼矿化和骨容量减少，利用 X 线摄 显著降低。与1α（OH）ase 小鼠相比，1α（OH）ase -/-
-/-
影、micro⁃CT扫描、三维重建分析和总胶原组织化学 p53 小鼠骨容量（图 2A、D、E）与骨矿化程度（图
+/-
染色的方法，比较分析了 10 周龄高钙磷饮食 WT、 2B、C）显著增加。上述结果证明p53 半剂量缺失能