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第44卷第6期           刘嘉浩，钱海声，高 欣，等. 基于生物信息学分析干性相关基因TCEAL7作为胃癌预后
                  2024年6月              标志物的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（6）：769-780                    ·771 ·


                1.2.8 增殖实验                                        分析对 11 个不同模块进行验证（图 3A）。在 P <
                    将GC细胞种入6孔板，37 ℃孵育14 d进行集落                     0.05和富集倍数>1的条件下，有8个模块与mRNAsi
                形成实验，使用结晶紫染色。将 GC 细胞种入 24 孔                       显著相关（图 3B）。根据模块⁃性状相关性的结果，
                板 ，使 用 EdU、DAPI 染 色 。 最 后 使 用 奥 林 巴 斯             蓝色模块被确定为与 mRNAsi 相关最显著的模块
                FSX100显微镜进行观察。                                   （r=-0.79，P=6×10 ）。设定阈值（cor.gene GS > 0.7
                                                                                  -79
                1.2.9 划痕实验和Transwell实验                            和 cor.Gene MM > 0.8），在蓝色模块的 504 个基因中
                    PBS 洗涤后，细胞在无血清培养基中孵育 48 h                     选择55个基因进行后续分析（图3C）。这些基因的
                进行划痕实验。使用显微镜观察并记录划痕宽度                             功能注释如图 4A、B 所示。结合临床信息并通过
                的变化。用基质胶预涂底室（100 μL/孔），30 min后                    LASSO回归分析，TCEAL7最终被确定为与mRNAsi
                加入培养基，进行迁移、侵袭实验。底室中添加含                            和GC预后高度相关的唯一关键基因（图4C、D）。
                血清的培养基，上室中添加含细胞的培养基。然后
                在37 ℃、5%CO2条件下孵育24 h。随后使用倒置显                              GTEx        TCGA
                                                                         database    databae
                微镜观察和拍照。

                1.2.10 球体形成实验TCEAL7的HGC⁃27
                    过表达 TCEAL7 和阴性对照的 HGC⁃27 细胞被                               DEG         mRNAsi    KM analysis
                播种在低黏附 6 孔板上，并在无血清 DMEM/F12 培
                养基中培养 10 d。培养基中添加表皮生长因子
                                                                                  WGCNA analysis
               （20 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（10 ng/mL）
                                                                                                     GO enrichment
                和 2%B⁃27，每 3 d 加入新的 1.5 mL 干细胞培养基。                                                     analysis
                                                                   TCGA clinical   gene modules
                使用显微镜计数球体。                                           feature      related to mRNAsi
                                                                                                    KEGG signaling
                1.2.11 流式细胞分析                                                                       pathways analysis
                    为了检测 CD44 和 CD24 的比例，APC 标记的
                                                                           LASSO Cox
                CD44 抗体和 PE 标记的 CD24 抗体在 4 ℃与细胞孵                            analysis      Exprssion
                                                                                           analysis
                育 30 min。随后在 PBS 中洗涤并重悬后，使用流式
                                                                                           Survival
                细胞仪分析。                                                      Key gene       analysis    GSE662299
                1.3  统计学方法
                                                                                         Establishment
                    采用 R 软件（版本 4.0.5）进行生物信息学分                                            of nomogram
                析。通过 Wilcox 秩和检验评估组间差异。应用                             图1 mRNAsi相关预后基因识别与验证的流程图
                Kruskal⁃Wallis 检验探讨 mRNAsi 和 TCEAL7 与临床           Figure 1  The flow chart for identification and verification
                                                                          of mRMAsi⁃related prognostic genes
                特征的相关性。使用 Pearson 相关探索 TCEAL7 和
                mRNAsi 之间的关系。使用 Kaplan⁃Meier 方法和                  2.2  mRNAsi和TCEAL7表达水平和生存分析
                Log⁃rank 检验进行生存分析。P < 0.05 为差异有统                      正常组织和肿瘤组织的 mRNAsi 分别如图 2B
                计学意义。                                             所示，肿瘤的 mRNAsi 显著高于正常组织。Kaplan⁃
                                                                  Meier 生存分析提示两组总生存期（overall survival，
                2  结 果
                                                                  OS）差异有统计学意义（图 2C）。此外，还比较了
                2.1  生物信息学分析                                      mRNAsi在不同T分期、淋巴转移、M分期和AJCC分
                    图 1 简要总结了本研究的工作流程。从 TCGA                      期的表达水平。但各组间差异无统计学意义（图
                数据库和 GTEx 数据库中寻找显著差异表达基因，                         5A~D）。如图 2E 所示，肿瘤组织中 TCEAL7 的表达
                经归一化和去除批次效应后，正常组与肿瘤组间共                            明显低于正常组。此外，TCEAL7 在胃癌 T1 分期中
                检测到 5 416 个 DEG，其中 1 672 个 DEG 表达上调，              表达最低（图 5E），在 AJCC 分期中也是如此（图
                3 744个DEG表达下调（图2A）。通过OCLR算法在                      5H），而在淋巴转移（图 5F）和 M 分期（图 5G）中，表
                TCGA数据库中的GC数据中寻找干性相关基因，然                          达水平差异无统计学意义。同时，应用Pearson回归
                后将差异基因和干性相关基因通过 WGCNA 分析，                         分析说明TCEAL7与mRNAsi呈负相关（图2D）。生
                选取5作为无标度拓扑模型β的软阈值，并通过聚类                           存分析发现 TCEAL7 表达高水平组与低水平组 OS
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