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第44卷第7期
               ·980 ·                          南   京 医 科       大 学      学 报                        2024年7月


              模，成为研究肠道上皮细胞功能及生命周期的主流载                                肠道类器官是起源于 Lgr5 干细胞的隐窝样单
                                                                                            +
              体，如何使肠道类器官这种优越的体外模型更好地发                           位，每个肠类器官都可以包含所有分化肠细胞类
              挥其优势，更加精确、全面地模拟包括各种疾病在内                           型，包括Paneth 细胞、吸收性肠细胞或结肠细胞、杯
              的各类体内条件，成为了当前的研究重点。                               状细胞和肠内分泌细胞等 ，慢病毒无法有效地感
                                                                                        ［8］
                  为了实现这个目标，研究团队进行了广泛尝                           染这样的3D结构。为了解决这个问题，研究者们倾
              试。考虑到类器官的特殊结构属性以及实验操作                             向于在进行后续的感染操作之前，先使用胰酶将类
              的难易度、实验周期长度和资金成本等因素，他们                            器官解离为单个细胞，同时，胰酶不仅可以将类器
              发现基因编辑是其中比较优越的一种方法。基因                             官消化成单个细胞，还可以让类器官的膜结构变得
              编辑是利用DNA 修复机制对基因组DNA 进行特定                         更疏松，使病毒颗粒更容易穿透，提高感染的成功
              位点修饰的技术 ，在过去的近 20 年中，基因编辑                         率 。但这样的感染过程涉及到对类器官的多次离
                                                                  ［9］
                             ［6］
              技术得到了迅速发展，为模拟各类疾病条件提供了                            心，可能导致类器官细胞活性的降低。为了避免这
              新的可能，而基因编辑技术与肠道类器官培养技术                            个问题，Maru 等    ［10］ 在 2016 年发表的论文中提到，将
              的结合无疑为肠道上皮的研究开辟了一条新的思                             类器官解离并与慢病毒颗粒混合，并将这一步骤得
              路。研究人员通过这样的组合，对肠道类器官进行                            到的类器官⁃慢病毒悬液接种在基质胶上孵育过夜
              功能上的调控，从而研究肠道在疾病条件下的功能                            以完成基因转导，这个方法既可以避免基质屏障对
              改变，尤其是肠道上皮在病理状态下发生的细胞结                            于慢病毒感染的抑制作用，也可以充分利用基质胶
              构与功能的变化，并且为如何调控或逆转这些改变                            对类器官的营养功能。作者还提到，接种后的类器
              提供了基因层面的研究基础。                                     官会自行转移至基质胶中，后续只需要进行换液，
                  本综述详细阐述了现有的几种肠道类器官基                           无需再次铺板、包埋，避免了细胞的二次损耗。
              因编辑技术及其在模型构建中的应用，同时对肠道                                 慢病毒虽然因其良好的转导效果得到了广泛
              类器官基因编辑技术的未来发展潜能及当前面临                             的应用，但其不足之处也十分明显，例如较长的实验
              的一些局限进行了讨论。                                       时间以及复杂的构建过程，慢病毒载体本身的致病性
                                                                和基因安全性也成为实验中需要注意的重点，病毒
              1  慢病毒感染
                                                                导致宿主基因突变的风险也不容忽视 ，这些问题成
                                                                                                 ［11］
                  慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒（human im⁃                     为了慢病毒感染控制类器官基因表达研究的难点。
              munodeficiency virus，HIV）为基础发展起来的基因               研究者们提出，为了规避这些可能出现的问题并且更
              治疗载体。2011 年，Koo 等 介绍了一种利用逆转                       大限度地利用慢病毒载体的优势，可以将慢病毒载体
                                      ［7］
                                                                                                      ［12］
              录病毒感染小鼠小肠类器官从而控制类器官基因                             与其他基因编辑技术如CRISPR/Cas9相结合 。
              表达的方法，文中提到慢病毒也可适用该方法对类                                 CRISPR 是一种 DNA 的短回文重复序列，通常
              器官系统进行基因调控。慢病毒载体对多种细胞                             与编码 CRISPR 相关（Cas）蛋白的基因一起存在于
              具有感染能力，并且能够稳定而持久地感染细胞，                            微生物基因组中        ［13］ 。CRISPR/Cas9是一种细菌适应
              在推广至类器官应用之前已被广泛、深入地应用于                            性免疫反应系统，凭借其高效、精确的特性，自发布
              细胞层面的基因编辑，但要将慢病毒感染在类器官                            以来就广泛用于基因组编辑              ［14］ 。目前，慢病毒转导
              层面上得到应用，还需考虑到类器官与传统的2D细                           CRISPR/Cas9 主要应用于肿瘤类器官的基因编辑，
              胞两者间的区别。                                          诱导肿瘤类器官的产生，2019 年，Takeda 等             ［15］ 使用

                  众所周知，类器官是一种在基质胶内培养的3D                         携带 Apc 和 Kras 突变的良性肿瘤类器官，验证了驱
              结构，基质胶为类器官的培养提供了营养支持和结                            动结直肠恶性肿瘤发生的基因突变，并且分别评估
              构支撑，对类器官的存活是不可或缺的。但由于慢                            了这些突变的致癌能力。2022年，Gu等               ［16］ 利用慢病
              病毒颗粒无法穿过基质胶，因此，如何让慢病毒在                            毒递送 CRISPR/Cas9，在 1~2 周内建立了基因突变
              成功感染类器官的同时又不影响其存活成为了技                             的结肠类器官。该团队表示，经过改良，慢病毒转
              术攻克的难关。研究团队们目前较常使用的方法                             导基因编辑的有效率可达到90%以上，与传统慢病
              是将基质胶溶解，在感染时使用的培养基中加入有                            毒转导30%~50%的有效率相比，这无疑是一次巨大
              助于肠道干细胞生长的因子以替代基质胶对类器                             的进步。类器官模型的使用使炎症性肠病（inflam⁃
              官生长的作用。                                           matory bowel disease，IBD）的研究也得到了发展，以
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