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第44卷第7期                  周   寅，俞   静，丁国宪. 肠道类器官基因编辑技术的研究进展［J］.
                  2024年7月                      南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（7）：979-984                       ·981 ·


                CRISPR/Cas9 为代表的基因编辑技术为 IBD 的诊疗                   器官的稳定性与存活能力造成一定程度的损伤。
                提供了新的思路        ［17］ 。虽然目前人们还不能通过肠                 是否存在一种技术，既能够稳定地转导目的基因，
                道类器官的基因编辑技术对IBD患者的肠道进行治                           又可以最大限度地降低对类器官的损害？研究者
                疗和修复，但这项技术的迅速发展提供了令人乐观                            们为了解决这个问题，仍然在不断地进行尝试，
                的前景和可能。                                           Nanoblades技术是其中一个比较成功的案例。

                2  脂质体转染                                          4  Nanoblades（NBs）
                    慢病毒载体转导目的基因的方法虽然高效、稳                              NBs是一种起源于小鼠白血病病毒（MLV）的病
                定，但所需的实验周期较长，过程也较为复杂，为了                           毒样颗粒（VLP），是通过CRISPR技术将VLP转导至
                克服这个缺点，研究者们尝试了使用脂质体作为载                            细胞内生成的一种基因编辑工具                  ［31- 33］ 。2023 年
                体对目的基因进行转染的方法。                                    Tiroille 等 ［34］ 建立了表达 eGFP 的小鼠结肠类器官，
                    2013 年，Schwank 等 ［18］ 利用脂质体转染 BAC 系           并通过NBs敲除eGFP以测试NBs的基因编辑能力，
                统成功在小鼠小肠类器官和人类结肠类器官上实                             结果提示，NBs可以达到最高70%的转导有效率，且
                施了瞬时转染荧光标记特定种类的细胞。细菌人                             没有明显的毒副作用，不会增加结肠类器官细胞死
                工 染 色 体（bacterial artificial chromosome，BAC）是     亡风险。该团队在人结肠、前列腺、乳腺类器官上利
                1992年Shizuya等  ［19］ 在大肠杆菌（E.coli）的单拷贝质            用慢病毒感染和电穿孔的方式分别进行了验证，得出
                粒 F 因子（F⁃plasmid）基础上构建的承载了大片段                     的结论仍然提示，NBs在人类类器官中也可以以最小
                DNA 的克隆载体，因其稳定、高效的优势得到了广                          的毒性做到高效的基因编辑。NBs的基因编辑水平
                泛的应用。这项技术相对比较简单，且适用范围相                            优于目前使用的其他技术，具有更低的毒性和更高的
                对较广。但可惜的是，由于质粒转染的瞬时性，类                            稳定性与准确性，并且需要的时间更短，使类器官的
                器官在接受转染后只能短暂地表达                ［20］ ，随着时间的        基因编辑技术变得更加成熟，为疾病发展、药物筛选
                推移，接受转染的类器官会逐渐丧失外源基因表达                            以及类器官治疗等临床应用提供了全新的可能。
                的能力，并且脂质体对类器官的存活可能造成一定
                                                                  5  电穿孔
                的影响，因此，脂质体介导的 BAC 转染类器官并没
                有得到广泛的应用        ［21-22］ 。                             前文描述了基因编辑的几种较为常见的载体，
                                                                  但由于类器官的结构特性，传统的基因载体无法直
                3  PiggyBac转座系统
                                                                  接将目的基因转导至类器官内。经过多种尝试后，
                    PiggyBac 转座系统来源于鳞翅目昆虫，是一种                     研究者们发现电穿孔是解决这个问题的有效方法。
                常用的真核 DNA 转座子。它具有特殊的双质粒系                              电穿孔是利用电脉冲增加细胞膜的通透性，从
                统，其中一个质粒表达携带目的基因的转座子，另                            而将 DNA、RNA、蛋白质或其他大分子转移至细胞
                一个表达具有切割DNA序列功能的转座酶，在转染                           的一种相对简单但有效的方法               ［35］ 。这种方法简单
                过程中，这两个结构相互配合，以“剪切⁃粘贴”的方                          易行，将类器官解离后悬浮于缓冲液内，并利用电
                式将目的基因转入靶细胞内。这样的功能特性保                             转仪（如 Nucleofector 或 NEPA21 等）进行电穿孔将
                证了 PiggyBac 转座系统的高效性与准确性，并且可                      目的基因载体转至细胞内            ［36-37］ 。上述研究方法建议
                以携带较大的基因片段 。与此同时，PiggyBac也可                       将类器官解离为单个细胞后再进行电穿孔操作，但
                                    ［23］
                以与 CRISPR 技术结合完成类器官的基因编辑                  ［24］ ，  这种方式很可能会降低类器官的存活能力，2017年
                推动了 PiggyBac 转染技术的发展和应用。近年来，                      Merenda等 ［38］ 研究显示，在实施电穿孔操作前，应将
                PiggyBac 因其可逆、高效率、高精准度、高可塑性的                      类器官解离为细胞团块，而非单细胞，以取得更好
                特性被广泛运用于基因组功能研究、基因编辑等领                            的转导效果。
                域 ［25-29］ ，不仅在肿瘤发生机制的研究和靶向药物的                         目前，研究者们已在人类结直肠癌、胰腺癌、肝
                开发上作出了贡献，在干细胞和再生医学领域也发                            癌和胃癌类器官上成功地利用电穿孔法进行了质
                挥了重要的作用 。                                         粒的转染    ［39］ 。电穿孔的优势在于对细胞数量的要
                              ［30］
                    上述的几种载体虽然在操作的便捷性和转染                           求较低，无需大量制备需要接受电穿孔的细胞，并
                的稳定性上各有优点，但他们都不可避免地会对类                            且所需实验时间较短，完成电穿孔后短时间内即可
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