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第42卷第12期        金多晨，黄可婷，徐 妙，等. 基于16S rDNA扩增子测序探究脱氧胆酸对肠型胃癌模型INS⁃GAS
                 2022年12月         小鼠胃内菌群结构的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（12）：1651-1657 ·1653                ·


                利伦理委员会审核批准（IACUC⁃2001024）。                        GAACGGATTTG，反 向 引 物 GGGGTCGTTGATG⁃
                1.2  方法                                           GCAACA；② Cdx2 正 向 引 物 CCGGAGACGATCT⁃
                1.2.1 模型建立                                        GAAACACG，反 向 引 物 GTGATGGTGCGCGTGG⁃
                    15只实验小鼠分为3组，分组如下：①5只FVB/N                     TAT；③ Klf5 正 向 引 物 CCGGAGACGATCTGAAA⁃
                野生型小鼠，饮用 0.2% DCA（实验组的基因型对                        CACG，反向引物 GTTGATGCTGTAAGGTATGCCT；
                照）；②5只INS⁃GAS小鼠，饮用生理盐水（normal sa⁃                 ④ Vil1 正 向 引 物 TCAAAGGCTCTCTCAACATCAC，
                line，NS）（实验组的饮水干预对照）；③5只INS⁃GAS                   反向引物 AGCAGTCACCATCGAAGAAGC；⑤Muc2
                小鼠，饮用 0.2% DCA（实验组）。0.2% DCA 饮水浓                  正向引物 ATGCCCACCTCCTCAAAGAC，反向引物
                度参考既往文献       ［10］ ，脱氧胆酸钠购自美国Sigma⁃Al⁃            GTAGTTTCCGTTGGAACAGTGAA。扩增程序为阶
                drich公司，生理盐水作为DCA的溶剂。所有小鼠自                        段1：预变性95 ℃ 30 s；阶段2：PCR反应，共40个循
                由进食采水，每周更换2次新鲜饮水，每日观察小鼠                           环，每个循环95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s；阶段3：
                活动状态，每周观察小鼠进食量及称重。持续饮水                            跑融解曲线，60 ℃ 1 min，最后95 ℃ 15 s结束。2           ⁃ΔΔCT
                干预 3 个月后，异氟烷麻醉后快速颈椎脱臼处死小                          法计算肠化标志物 cdx2、klf5、vil1 和 muc2 mRNA 相
                鼠，游离鼠胃，沿胃大弯剖开取胃内容物。胃内容物                           对表达水平。
                标本在-80 ℃运送至苏州帕诺米克生物医药科技有                          1.3  统计学方法
                限公司行16S rDNA扩增子测序。胃黏膜组织迅速放                            本项研究实验组为 DCA 饮水干预 INS⁃GAS 小
                至冰PBS中漂洗除去残余胃内容物，然后按部位将黏                          鼠，设置两个对照组，分别为NS饮水的INS⁃GAS小鼠
                膜分为胃体及胃窦，暂存于-80 ℃并尽快进行提                          （饮水干预的对照组）和DCA饮水的FVB/N小鼠（基
                RNA、逆转录及荧光实时定量PCR测定。                              因型对照组），因此后续进行INS⁃GAS（NS）组与INS⁃
                1.2.2 胃内菌群分析                                      GAS（DCA）组、FVB/N（DCA）组与 INS⁃GAS（DCA）组
                    菌种相对丰度分析：将相似性超过 97%的操作                        的两两比较。应用R软件进行统计分析，α多样性指
                分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析          数分析采用两组之间Wilcoxon秩和检验，β多样性分
                进行物种注释，分析每组样本在“门、纲、目、科、属、                         析采用非参数检验Anosim分析判断组间差异是否显
                种”各分类水平丰度排名前10的菌种及其比例。                            著大于组内差异，LDA评分大于4为组间丰度有显著
                    α多样性指数分析组间差异，反映各组样本胃                          差异的菌种。P < 0.05为差异有统计学意义。
                内菌群多样性和丰富度。采用 ACE 指数和 Chao1
                                                                  2  结 果
                指数分析各组小鼠胃内菌群丰度，Shannon 指数和
                Simpson指数分析菌群多样性。                                 2.1  各组小鼠一般情况
                    β多样性分析是针对各个样本间菌群结构差异                              在3个月的饮水干预期内，各组小鼠均无死亡，
                的比较，基于OTU水平的主成分分析（principal com⁃                  活跃度可，且进食量无显著差异（P > 0.05）。在此基
                ponent analysis，PCA）可以将这种菌落结构的差异进                 础上，分析了各组小鼠实验期间体重变化，发现INS⁃
                行二维展示，通过各个样本的聚散情况来判断各组                            GAS（DCA）小鼠体重与其他两组相比，均无显著差
                菌群结构差异度。                                          异（P均> 0.05，图1）。
                    差异物种分析采用LEfSe（LDA Effect Size）分析              2.2  各组小鼠胃内菌群分析
                各组具有统计学差异的物种（生物标志物），包括                            2.2.1 各组小鼠胃内优势菌种分析
                LDA值分布柱状图、进化分支图和各组生物标志物                               图2A、B分别为门和属水平上各组小鼠胃内相
                丰度比较图，本研究纳入LDA值分布柱状图。                             对丰度排名前 10 的菌种。在门水平上，INS⁃GAS

                1.2.3  胃体及胃窦组织肠化标志物 mRNA 表达水                     （NS）小 鼠 胃 内 相 对 丰 度 最 高 菌 种 为 厚 壁 菌 门
                平测定                                              （66.84%），其次为蓝藻细菌门（29.72%）；DCA 饮水
                    使用TRIzol提取组织总RNA并测定浓度，采用                      改变了 INS⁃GAS 小鼠胃内优势菌种，蓝藻细菌门
                日本 TaKaRa 公司 PrimeScript RT Master Mix 试剂        （58.70%）占比高于厚壁菌门（34.06%）；而在 FVB/N
                                          TM
                盒和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（RR820A）试剂盒依           （DCA）小鼠胃内两者相对丰度大致相同，分别为蓝
                次进行逆转录及实时定量 PCR。所用小鼠引物序                           藻细菌门（45.30%）、厚壁菌门（51.55%）。
                列（5′→3′）如下：①Gapdh 正向引物 AGGTCGGTGT⁃                    在属水平上，INS⁃GAS（NS）小鼠胃内相对丰度
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