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第44卷第12期
               ·1630 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年12月


                  环磷酰胺是一种常用的治疗实体癌症和血液                                此外，肿瘤抑制因子P53是一种多功能蛋白，参
              系统恶性肿瘤的化疗药物，包括乳腺癌、骨癌、软                            与细胞凋亡和自噬，在调节颗粒细胞的凋亡中起重
              组织肉瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血                            要作用。P53介导的细胞凋亡主要通过调控促凋亡
              病 ，也是系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病患者                            和抗凋亡因子（如BAX，BCL2 通路）实现              ［16］ 。P53基
                ［1］
                             ［2］
              的一线治疗药物 。环磷酰胺是一种烷基化剂，在                            因在大多数人类肿瘤中丢失、突变或失活。因此，
              抗肿瘤治疗同时也会引起一系列的脱靶效应，包括                            在不影响药物的抗癌能力的情况下，P53 已成为治
              膀胱损害、免疫抑制和与卵巢卵泡衰竭相关的闭                             疗化疗药物不良反应的理想靶点                 ［17］ 。在环磷酰胺
              经 ，它的活性代谢产物具有强烈的促性毒性作                             诱导的早发性卵巢功能不全（premature ovarian in⁃
                ［3］
              用 ［4］ ，对卵巢具有不可逆的细胞毒性               ［5］ 。在现代       sufficiency，POI）模型的小鼠中，颗粒细胞中 P53 的
              生活中，肿瘤的发病率在年轻人群中逐渐升高，这                            表达水平显著增加         ［18］ 。然而，4⁃HC对颗粒细胞的损
              使得使用化疗药物的育龄女性其卵巢受损的发生                             伤机制是否与体内实验中观察到的P53表达水平变
              率也越来越高。研究发现，35 岁以下接受化疗的                           化相关仍不清楚。因此，本研究通过使用不同浓度
              女性中约有30%出现早发性卵巢功能不全，而35岁                          和不同暴露时间的4⁃HC处理SVOG细胞，建立一个
              至 40 岁女性，这一比例升至 50% 。先前研究表                        卵巢颗粒细胞体外损伤模型，并初步探索4⁃HC在人
                                            ［6］
              明，化疗药物，特别是烷基化药物如环磷酰胺的使                            卵巢颗粒细胞线粒体中的作用以及其潜在机制。
              用，会导致原始和窦前卵泡的消耗 ，引起卵巢早
                                              ［7］
                                                                1  材料和方法
                ［8］
              衰 。尽管有相应的临床措施，比如生育力保存技
              术可以使接受化疗药物治疗的患者有几率保存一                             1.1  材料
              定的生育能力，但其冻卵复苏后的功能恢复效果                                  卵巢颗粒细胞SVOG细胞系由江苏省人民医院
                             ［9］
              尚不能完全确定 ，因此探索 4⁃羟基过氧环磷酰胺                          生殖中心实验室赠予。4⁃HC（MCE 公司，美国）；双
             （4⁃Hydroperoxy cyclophosphamide，4⁃HC）诱导细胞          抗胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Cell science公
              损伤的机制，特别是在卵巢颗粒细胞中的作用机                             司，美国）；1640 细胞培养基（Gibco 公司，美国）；二
              制，对于探索减少临床治疗策略的不良反应以及                             甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美
              研制新的防治方法至关重要。                                     国）；CCK⁃8、FastPure 细胞/组织总 RNA 提取试剂盒
                  卵巢颗粒细胞对外界损伤（如化疗药物）高度                         （南京诺维赞公司）；JC⁃1 试剂盒、4%多聚甲醛固定
              敏感，是环磷酰胺诱导卵巢毒性的重要靶点                    ［10］ 。研    液、封闭液（上海碧云天公司）；戊二醛固定液（北京
              究表明，环磷酰胺化疗显著诱导颗粒细胞凋亡                      ［11］ ，  百瑞极公司）；Anti⁃Parkin 抗体、Anti⁃Pink1 抗体、
              并通过减少非静息颗粒细胞产生的性激素含量导                             Anti⁃P62抗体、Anti⁃Vinculin抗体、Anti⁃MDM2抗体，
              致卵巢卵泡闭锁        ［12］ ，最终损伤卵巢功能。虽然环磷                Anti⁃TOMM2O抗体，Anti⁃β⁃actin抗体（Proteintech公
              酰胺本身在体外无法发挥相应作用，但其活性代谢                            司，美国）；Anti⁃P53抗体（Abcam 公司，美国）；Triton
              产物4⁃HC能够通过增加氧化应激和细胞凋亡，损伤                          X⁃100（BioFroxx 公司，德国）；Dapi⁃Fluoromount⁃G 抗
              颗粒细胞功能，进而引发卵巢功能不全                  ［13］ 。环磷酰      荧光淬灭封片剂（SouthernBiotech 公司，美国）；山羊
              胺还通过激活BAX和线粒体凋亡通路，诱导生长卵                           抗兔 IgG（H+L）二抗 Alexa Fluor 594 标记；山羊抗
                                                                                             TM
              泡中颗粒细胞的凋亡          ［12］ 。一项体外研究表明，将小              鼠 IgG（H+L）二抗 Alexa Fluor 488 标记（Thermo 公
                                                                                           TM
              鼠卵巢组织与4⁃HC共培养96 h后，次级卵泡的颗粒                        司，美国）。
                              ［14］
              细胞出现显著凋亡 。因此，环磷酰胺及其代谢产物                           1.2  方法
              4⁃HC严重损害卵巢细胞的正常功能。线粒体是提供                          1.2.1 细胞培养和4⁃HC处理
              能量和维持稳态的重要细胞器，广泛存在于卵母细胞                                将 SVOG 细胞接种于含有 1%双抗和 10% FBS
              以及颗粒细胞中。近期研究发现，腹腔注射环磷酰胺                           的1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱
              的小鼠，其卵巢中线粒体自噬相关Pink1和Parkin的                      中培养，每 3 d 更换 1 次培养基。以 DMSO 为溶剂，
              表达水平增加，导致线粒体功能受损，并使得卵巢中                           配制 4⁃HC 溶液储存浓度为 100 mmol/L 并以氮气封
              活性氧水平升高 。然而，4⁃HC损伤卵巢颗粒细胞                          闭，置于-80 ℃储存。将4⁃HC添加到传代后且细胞
                            ［15］
              的具体机制依然不明确，关于其在卵巢颗粒细胞中对                           贴壁的目标培养液中，使得4⁃HC 最终浓度分别为：
              线粒体的影响及相关机制仍需要进一步探索。                              0.2、2.0、10.0 μmol/L，混 匀 培 养 24、48、72 h。 以
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