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第44卷第12期 赵辰希，徐 聪，谢思远，等. 4⁃羟基过氧环磷酰胺通过靶向P53损伤人卵巢颗粒细胞线粒体自噬
2024年12月 功能的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（12）：1629-1637 ·1631 ·

DMSO为溶剂对照组，DMSO最终浓度小于0.1%。 1.2.5 实时荧光定量 PCR（RT⁃qPCR）检测相关
1.2.2 CCK⁃8法检测SVOG细胞活力 mRNA的表达
接种细胞至96孔板，终体积为100 μL。12 h后 采集样品后，加入 5 μL RNA 保护剂和 340 μL
显微镜下观察细胞贴壁情况，并加入相应浓度的 RLT 缓冲液（包含 1%β⁃巯基乙醇）及 5 μL 载体
4⁃HC 到孔板中，设置空白对照组（仅有培养基）、对 RNA，以防总 RNA 降解。将样品转移到装有 gDNA
照组、溶剂对照组（DMSO）、实验组（4⁃HC 浓度为： 吸附柱的 2 mL 收集管中，在 4 ℃下以 12 000 g 离心
0.2、2.0、10.0 μmol/L），每组 3 个复孔。放回培养箱 30 s，弃掉滤柱，保留收集管里的液体。向收集管中

培养24 、48、72 h。96孔板中避光加入10 μL CCK⁃8 加入等体积的350 μL 70%乙醇，并充分混合。将样
工作液，在培养箱中避光孵育 3 h，酶标仪检测 品和沉淀物一起转移到 RNeasy 离心柱，密封后在
450 nm 处的吸光值。各组吸光度按照下列公式计 4 ℃、12 000 g 离心 15 s，移除液体。加入 700 μL
算：（A-C）/（B-C）×100%（A：实验组或溶剂对照组吸 RW1 到柱中，再次密封和离心，弃掉液体。加入
光度值，B：对照组吸光度值，C：空白对照组吸光度 500 μL RPE液，重复密封和离心步骤并弃液。随后
值），换算为细胞活力百分比。 用 800 μL 80%乙醇清洗离心柱，离心 2 min 后弃掉
1.2.3 JC⁃1检测线粒体膜电位 流出液和收集管。将离心柱放在新的 2 mL 收集管
细胞在 6 孔板中贴壁培养 24 h 后，弃去原始培 上，开盖全速离心以干燥，换上1.5 mL无RNA酶管，
养基，加入配制好的 1 mL JC⁃1工作溶液，在37 ℃下 加入 14 μL 超纯水，离心 1 min 收集 RNA，立即冷冻
孵育 20 min。移除上清液，缓冲液洗涤两次，加入 或逆转录。冰上解冻cDNA逆转录试剂盒并进行涡
2 mL培养基，最后在共聚焦显微镜下观察细胞线粒 旋和离心，将样本逆转录为cDNA。以GAPDH 为内
体膜电位。 参基因，RT⁃qPCR 反应体系（20 μL）：2×TB Green
1.2.4 透射电镜观察线粒体超微结构 Master，Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）
收集 SVOG 细胞并以 2.5%戊二醛为固定液室 各0.4 μL，无菌蒸馏水7.2 μL。上机，按照程序流程
温固定 1 h，使用伊红染色，将细胞包裹于琼脂糖中 设置温度和时间进行反应。引物序列见表1。
并离心，使SVOG细胞聚集于EP管底。待琼脂糖凝 1.2.6 蛋白质印迹实验
固后再加入戊二醛固定，冰上送至南京医科大学分 SVOG细胞在加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液
析 测 试 中 心 进 行 后 续 工 作 。 制 样 后 使 用 JEM ⁃ 中裂解，并在冰上放置30 min。随后离心并收集上清
1400Flash透射电子显微镜观察结构。 液测定蛋白浓度，将样品在 95 °C 下变性 5~10 min。

表1 RT⁃qPCR引物序列
Table 1 RT⁃qPCR primer sequences
Gene name Forward primers Reverse primers
P53 5′⁃ACTAAGCGAGCACTGCCCAAC⁃3′ 5′⁃CCTCATTCAGCTCTCGGAACATC⁃3′
Parkin 5′⁃CGTGTGATTTTTGCCGGGAAG⁃3′ 5′⁃CCACTCGTGTCAAGCTC⁃3′
Pink1 5′⁃GGCTTCCGTCTGGAGGATTAT⁃3′ 5′⁃CCTGCCGAGATATTCCACA⁃3′
GAPDH 5′⁃GACGCTGGTGCTGGTATTGCT⁃3′ 5′⁃CTACTCCTTGGACGGCCATGTGT⁃3′

之后，将 20 μg 蛋白加到 10%或 12%的 SDS⁃聚丙烯 后并封闭，加入配制好的抗体，在 4 ℃下孵育过夜。
酰胺凝胶中，并以 120 V 进行电泳 1.5 h。分离后的 次日，细胞爬片与 CoraLite488 标记的山羊抗小鼠
蛋白质随后被转移到硝酸纤维素膜上，之后将膜 IgG（H+L）和山羊抗兔 IgG 抗体（H+L）在室温下孵
置于封闭缓冲液（5%脱脂奶粉、0.05% Tween⁃20， 育 1 h。细胞核使用DAPI进行染色。通过共聚焦显
20 mmol/L Tris 缓冲盐溶液，pH 8.0）中，在室温下孵 微镜采集信号。
育至少1 h，并在4 ℃下与一抗过夜孵育。随后与辣 1.3 统计学方法
根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗孵 所有统计学结果均采用 GraphPad Prism 8 进
育1 h，化学发光法检测信号。 行分析，所有数据均以均数±标准差（x ± s）表示，
1.2.7 免疫荧光法 两组资料间比较采用独立样本 t 检验，多组资料
细胞在4%多聚甲醛中固定15 min，通透细胞膜 间比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有