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第45卷第10期          任 钰，李超普，张 许，等. 肥胖相关基因Stambpl1的生物信息学筛选及其对脂代谢影响
                 2025年10月            的初步探究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1417-1426，1466               ·1419 ·


               （Thermo Fisher 公司，美国）；Stambpl1 抗体（Santa            酸序列，再使用诺维赞官网工具CE Design进行引物
                Cruz 公司，美国），Calnexin 抗体（Cell Signaling Tech⁃      设计，输入基因编码区序列生成带有同源臂的同源
                nology公司，美国）。                                     重组引物。上游引物为5′⁃tactctagagctagcgaattcATG⁃
                1.2  方法                                           GAGCAGCCATTCACTGTG⁃3′，下游引物为 5′⁃gtcg⁃
                1.2.1  差异基因获取及基因本体（gene ontology，                 gatccctcgaggaattcTCACCTCAGATCCAACACAGTTGT⁃
                GO）分析和表型富集                                        3′，其中大写碱基片段为目的基因（Stambpl1）编码
                    在 GEO 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/     区序列，小写碱基片段为同源臂序列，使 PCR 扩
                geo/）中以“HFD”和“WAT”作为关键词获取符合要                      增产物可通过同源重组技术与线性化的载体高
                求的数据集 GSE30247、GSE37218。GSE30247 数据               效连接，实现目的基因在载体中的定向克隆。使

                集基于Affymetrix GPL1261平台，其中包含4只HFD                 用 TRIzol 从 3T3⁃L1 细胞中提取 RNA，利用逆转录
                喂养和4只普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠eWAT转                       试剂盒进行逆转录获取模板cDNA。实时定量PCR
                             ［9］
                录组测序数据 ；GSE37218 数据集基于 Affymetrix                 进行目的基因片段扩增，总反应条件为：95 ℃预变
                GPL6246 平台，其中包含 3 只 HFD 喂养和 3 只普                  性 10 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸
                通饲料喂养的 C57BL/6J 小鼠 eWAT 转录组测序数                    40 s，完成 32个循环后再延伸5 min。
                据 ［10］ 。利用 NCBI 在线工具 GEO2R，将普通饲料喂                     使用 PCDH C⁃Flag 作为载体进行过表达质粒
                养的小鼠脂肪转录组数据设为对照组，HFD喂养的                           构建，首先用限制性内切酶 EcoRⅠ对载体进行线
                小鼠脂肪转录组数据作为实验组，以 P < 0.05、                        性化，再将线性化后的载体与 PCR 扩增产物进行
                log2FC>1.5 作为筛选标准进行差异分析。利用在线                      同源重组连接，连接产物转化 Stbl3 感受态细胞扩
                韦恩图（Eveen）获取共同差异基因。利用在线工具                         增并提取质粒。当 HEK293T 细胞密度达到 70%~
                Enrichr（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）对 差 异 基  80%时使用 PEI将慢病毒的2种包装质粒（psPAX2、
                因进行 GO、哺乳动物表型本体（mammalian pheno⁃                  pMD2.G）和过表达重组质粒共同转染进 HEK293T
                type，MP）和人类表型本体（human phenotype ontolo⁃           细胞，6~8 h后更换为完全培养基，分别收取48 h和
                gy，HPO）富集分析。                                      72 h的病毒上清备用。
                1.2.2  PPI网络的构建及hub gene的筛选                       1.2.5 慢病毒感染和稳定过表达Stambpl1的3T3⁃L1
                    将获得的共同差异基因输入到 STRING12.0                      细胞株筛选
               （https：//string⁃db.org）数据库中构建PPI网络并将其                  将 3T3⁃L1 细胞接种到 6 孔板（感染前密度达到
                导入Cytoscape3.10.2软件，利用CytoHubba工具计算               50%左右）后，将病毒上清与完全培养基 1∶1 混匀，
                节点属性，使用 BottleNeck、Betweennes 和 Stress 3 种        并加入终浓度为 8 mg/mL 的聚凝胺。将混合物加
                算法筛选出得分排名前 20 的 hub gene 并获取不同                    入 3T3⁃L1 细胞。感染 24 h 后换液，48 h 后更换含
                算法得到的共同hub gene。                                  有 2 mg/mL 嘌呤霉素的培养基进行稳定过表达 St⁃
                1.2.3  Hub gene的表达验证                              ambpl1的3T3⁃L1细胞筛选。
                    在 GEO 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/     1.2.6  3T3⁃L1前脂肪细胞的培养及处理
                geo/）中以“HFD”和“WAT”作为关键词获得编号为                          3T3⁃L1 细胞使用含 10%小牛血清的 DMEM 培
                GSE138632 的数据集，该数据集基于 GPL24247 平                  养基培养，培养条件为37 ℃、5% CO2，隔天更换新鲜
                台 ，包 含 4 只 HFD 喂 养 和 4 只 普 通 饲 料 喂 养 的            培养基，密度为 80%~90%时传代。OA 处理时，将
                C57BL/6J 小鼠的 iWAT 转录组测序数据          ［11］ 。使用 R     3T3⁃L1 细胞接种于 12 孔板和活细胞培养皿中，将
                包limma和ggplot2分析数据集获得基因表达矩阵和                      OA和牛血清白蛋白按摩尔比7∶1混合并调整OA终
                差异基因，进一步验证上一步获得的 hub gene 的表                      浓度为 300 μmol/L，在 37 ℃水浴锅中孵育 1 h 后处

                达。利用同样的数据库，绘制 ROC 曲线判断 hub                        理3T3⁃L1细胞16 h。
                gene 在肥胖发生中的预测效果。最后利用 RT⁃PCR                      1.2.7  3T3⁃L1细胞BODIPY染色及TG水平检测
                技术，在HFD诱导的肥胖小鼠模型脂肪组织中检测                               使用 300 μmol/L OA 处理 3T3⁃L1 细胞 16 h 后，
                上述分析获得的最终候选基因的表达。                                 按照1∶1 000将BODIPY和Hoechst与完全培养基混

                1.2.4  Stambpl1过表达载体构建及慢病毒包装                      合，孵育细胞30 min，使用荧光共聚焦显微镜观察脂
                    在 NCBI 中检索 Stambpl1 获得基因编码区氨基                 滴并拍摄。使用Image J 1.54将荧光图转为灰度图，
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