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第45卷第11期 林俊杰，孙君健，王 璐，等. IFN⁃γ通过抑制SRC/Areg信号轴减轻克罗恩病肠纤维化［J］.
2025年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（11）：1608-1615，1625 ·1609 ·

克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种反复发 第一附属医院普外科接受手术治疗的6例CD合并肠
［1］
作的慢性消化道炎症性疾病 。随着病程进展，肠 纤维性狭窄患者。所有患者均经临床确诊并接受病
道狭窄发生率逐渐升高，约 60%的 CD 患者在确诊 变肠段切除术 ，且研究方案已获得医院伦理委员会
［18］
后的20年内会出现一次肠道狭窄，引发肠梗阻甚至 批准（批件号：2023⁃SR⁃852）。手术过程中，分别采集
肠穿孔 ［2-5］ 。肠道狭窄的病理基础是肠道纤维化，尽 狭窄段肠管及其近端配对样本的非狭窄段全层肠壁
管近年来临床出现了多种生物制剂，但目前尚无证 组织，每例患者至少获取2组配对样本。组织标本经
据表明生物制剂可逆转肠道纤维化 ［3，6］ 。肠狭窄及 生理盐水冲洗后，分为两部分处理：第一部分用于分
其所引发的肠穿孔等一系列并发症已成为CD诊治 离肠道成纤维细胞，第二部分立即投入液氮速冻并转
的难点 ［1，7］ 。 移至-80 ℃超低温冰箱保存。样本采集全程严格遵
目前，CD 肠道纤维化的发病机制仍未完全明 循无菌操作规范，并建立了完整的临床资料数据库，
确，通常认为是遗传易感性、环境因素、肠道菌群 涵盖患者基本资料、病程、药物治疗史等关键信息。
失衡以及免疫调节异常等多种因素共同作用的结 1.1.2 实验试剂
果 ［8-11］ 。在分子层面，慢性炎症微环境中免疫细胞 磷酸盐缓冲液（phosphate⁃buffered saline，PBS）、
与间质细胞之间的相互作用被认为是推动纤维化 Hochest33342（上海碧云天）；封闭用山羊血清（上海
进程的关键环节。多种免疫细胞，如辅助型 T 细胞 Biosharp 公司）；胎牛血清（浙江天杭）；DMEM 高糖

2（T helper 2 cell，Th2）、调节性 T 细胞（regulatory T 基础培养基（Gibco公司，美国）；Hank’s平衡盐溶液
cell，Treg）细胞、巨噬细胞等，通过分泌特定细胞因 （HBSS，南京凯基）；双抗（青霉素⁃链霉素混合液）、
子，持续激活肠道成纤维细胞，进而导致细胞外基 三抗（青霉素⁃链霉素⁃庆大霉素混合液，Invitrogen公
质（extracellular matrix，ECM）过度沉积以及组织结 司，美国）；二硫苏糖醇（DTT）、EdU 检测试剂盒（上
构重塑 ［12-13］ 。在这一复杂的细胞因子网络中，转化 海翌圣公司）；总RNA提取试剂TRIzol（Thermo Fisher
生长因子⁃β（transforming growth factor beta，TGF⁃β） 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 试剂盒（南京诺唯
被广泛认为是最重要的促纤维化因子，然而对于 赞公司）；Ⅰ型胶原蛋白（collagen Ⅰ，COL1A1）、Ⅵ
其他细胞因子的研究相对较少 ［14］ 。 型胶原蛋白抗体（collagen Ⅵ ，COL6A1）、Ki67 抗体
本课题组前期研究发现，双调蛋白（amphiregu⁃ （Abcam 公司，美国）、α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth
lin，Areg）作为表皮生长因子家族的一员，在 CD 肠 muscle actin，α⁃SMA）抗体（Santa Cruz公司，美国）。
纤维化组织中表达显著上调，并能显著促进肠成纤 1.2 方法
维细胞的活化和胶原合成 ［14-15］ 。这一发现提示Areg 1.2.1 原代人肠道成纤维细胞提取
可能是连接炎症反应与纤维化进程的关键介质。 本研究采用组织块贴壁法分离培养原代人肠
值得注意的是，干扰素⁃γ（interferon⁃gamma，IFN⁃γ） 道成纤维细胞 ［14，19-20］ 。具体操作如下：手术切除的
作为典型的Th1型细胞因子，在CD发病中具有双重 狭窄段和非狭窄段组织迅速置于含 1%三抗的 PBS
作用：既参与炎症反应，又具有抗纤维化潜能 ［16-17］ 。 中保存；超净工作台内用HBSS充分冲洗标本，精细
然而，IFN⁃γ是否通过调控Areg表达影响CD肠纤维 分离并去除黏膜上皮层、肌层及浆膜层，保留黏膜
化进程目前并未有研究。 固有层并制备成2~3 cm条状组织（每次3~4条）；组
基于以上研究背景和科学问题，本研究拟通 织块依次经 DTT 溶液（75 mg/50 mL HBSS）处理 10~
过 不 同 细 胞 因 子 处 理 CD 肠 成 纤 维 细 胞 ，探 究 15 min、HBSS 漂洗后，置于 2.5%三抗⁃HBSS 溶液中
IFN⁃γ在肠纤维化中的作用及机制。这些研究不 孵育3 h（每20 min翻转1次）；处理后的1 mm×1 mm
仅有助于阐明 IFN⁃γ在肠纤维化中的复杂作用，还 组织块均匀贴附于划格培养皿，滴加少量DMEM完
可能为开发靶向干预策略提供新的理论依据和治 全培养基 37 ℃过夜培养促进贴壁后补足 10 mL 完
疗靶点。 全培养基，每 3 d 更换 5 mL 培养基；培养 4~7 d 后组
织边缘可见细胞迁移，待成纤维细胞形成后移除组
1 材料和方法
织块，继续培养 3~4 周后采用 0.25%胰酶消化传
1.1 材料 代。全部实验过程均在生物安全柜中完成，使用含
1.1.1 组织样本 10%胎牛血清和1%双抗的培养基维持培养，并定期
选取2024年3月—2025年3月在南京医科大学 通过显微镜观察细胞形态变化。