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第45卷第11期
               ·1610 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年11月


              1.2.2 细胞培养及处理                                     性细胞比例（EdU阳性细胞数/总细胞数×100%）。
                  人肠成纤维细胞分为 7 组，分别为空白对照组                        1.2.6 细胞免疫荧光染色及Ki67染色
              及 6 种细胞因子处理组，处理组分别使用以下细胞                               当细胞融合度达到 90%~95%时，予 0.25%胰酶
              因子刺激人肠道成纤维细胞 48 h：IFN⁃γ（20 ng/mL）、                消化并计数，按 1×10 个/孔接种于 12 孔板，37 ℃培
                                                                                   4
              白 介 素（interleukin，IL）⁃17A（50 ng/mL）、IL⁃1β         养过夜。待细胞贴壁后，更换无血清培养基进行6~
             （10 ng/mL）、IL⁃33（100 ng/mL）、IL⁃36α（200 ng/mL）、肿    12 h饥饿处理，随后分别加入重组IFN⁃γ（20 ng/mL）
              瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）⁃α（20 ng/mL）。     和TGF⁃β（5 ng/mL）刺激48 h。实验过程中，先用PBS

              1.2.3 Real⁃time PCR                               洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS 再次洗
                  采 用 TRIzol 法 提 取 各 组 细 胞 总 RNA 后 ，经           涤后，0.1% Triton X⁃100 处理 20 min 实现细胞膜通
              Nanodrop 检 测 RNA 浓 度 及 纯 度［D（260 nm）/D            透，10%山羊血清封闭 2 h。采用α⁃SMA 抗体（1∶
             （280 nm）：1.8~2.0］。参照逆转录试剂盒操作流程，                    100）和 Ki67 抗体（1∶100）4 ℃过夜孵育，Alexa Fluor
              取 1 μg 总 RNA 进行 cDNA 合成。qPCR 反应使用                 594 标记的二抗 37 ℃避光孵育 1 h，DAPI 染色细
              SYBR Green法在ABI 7500系统上完成，引物序列由                   胞核 10 min，所有洗涤步骤均采用 PBS 浸洗 3 次，

              擎科生物合成：COL1A1（F：5′⁃GAGGGCCAAGAC⁃                  每次 5 min。最后封片并在Leica THUNDER高分辨
              GAAGACATC ⁃ 3′ ，R：5′ ⁃ CAGATCACGTCATCGCA⁃         荧光显微镜下观察并获取图像。
              CAAC⁃3′）；COL6A1（F：5′⁃ACAGTGACGAGGTGGA⁃            1.2.7 转录组测序（RNA sequencing，RNA⁃seq）
              GATCA ⁃ 3′ ，R：5′ ⁃ GATAGCGCAGTCGGTGTAGG ⁃              本研究采用20 ng/mL IFN⁃γ处理人肠成纤维细
              3′）；COL6A3（F：5′⁃ATGAGGAAACATCGGCACTTG⁃            胞 48 h（每组设 3 个生物学重复），随后使用 TRIzol
              3′，R：5′⁃GGGCATGAGTTGTAGGAAAGC⁃3′）；Acta2           试剂同步裂解IFN⁃γ处理组和对照组细胞并提取总
             （F：5′⁃AAAAGACAGCTACGTGGGTGA⁃3′，R：5′⁃GC⁃            RNA，样本送交华大基因进行 RNA⁃seq 测序及生物
              CATGTTCTATCGGGTACTTC ⁃ 3′ ）；GAPDH（F：5′ ⁃          信息学分析。
              GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT⁃3′，R：5′⁃GGCTGTT⁃            1.3  统计学方法
              GTCATACT⁃TCTCATGG⁃3′）。PCR 反应程序：95 ℃                    使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学处
              预变性 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。采用             理。数据以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采
              2 -ΔΔCt 法分析基因相对表达量，GAPDH作为内参基因                    用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分
              进行标准化。                                            析，方差齐性时选用 Tukey 检验，方差不齐时采用
              1.2.4 Western blot                                Games⁃Howell检验进行事后分析。所有统计检验均
                  将蛋白样品加入预制好的SDS⁃PAGE凝胶上样                       采用双侧检验，显著性水平设定为α=0.05。
              孔中，以 100 V 恒压电泳至分离胶底部。电泳完成
                                                                2  结 果
              后，用无水乙醇激活 PVDF 膜，采用湿转法（250 mA
              恒流，冰浴冷却）将蛋白转移至 PVDF 膜上。转膜                         2.1  Areg促进肠道成纤维细胞活化及增殖
              后，用 5%脱脂牛奶室温封闭 1 h，TBST 漂洗后加入                          Western blot 检测结果显示，经 Areg 处理 48 h
              一抗，4 ℃孵育过夜（≥12 h）。次日，TBST 洗膜 3 次                  后，肠道成纤维细胞中胶原蛋白 COL1A1、COL6A1
             （10 min/次），加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，再                     及活化标志物α⁃SMA 的表达水平较对照组均显著
              次TBST漂洗3次。滴加ECL显影液，使用凝胶成像                         上调（图1A）。EdU细胞增殖实验进一步证实，Areg
              系统检测信号。                                           可显著增强肠道成纤维细胞的增殖能力（图 1B）。
              1.2.5 EdU染色                                       上述结果表明，Areg通过促进肠道成纤维细胞的胶
                  采用 EdU 标记法检测细胞增殖活性。待测细                        原蛋白合成、细胞活化和增殖，在CD相关肠纤维化
              胞以含 20 μmol/L EdU 的培养基孵育 4~6 h（依细胞                进程中发挥重要作用。

              增殖速率优化），4%多聚甲醛固定 15 min，0.5%                      2.2  IFN⁃γ抑制肠成纤维细胞Areg表达
              Triton X⁃100透化20 min后，通过铜催化的点击化学                       肠道免疫功能紊乱是CD 患者肠纤维化发生发
                                                                                                           ［10］
                           ®
              反应（Click⁃iT ）将荧光标记叠氮化物（Alexa Fluor                展的关键因素，多种细胞因子参与这一病理进程 。
              594）与 EdU 共价结合，避光反应 30 min。细胞核以                   TGF⁃β作为重要的促纤维化因子，可通过促进细胞
              Hochest33342 复染，荧光显微镜观察并计算 EdU 阳                  外基质合成参与组织修复             ［21］ 。课题组前期研究发
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