Page 34 - 南京医科大学自然版
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第45卷第5期
               ·620 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年5月


                  移植肾间质纤维化作为慢性移植肾失功（chronic                     主动脉和腔静脉吻合，将供体的输尿管连接到受体的
                                                                                                  ［12］
              renal allograft dysfunction，CAD）的病理组织学特征，         膀胱。移植手术后7 d再切除对侧肾脏 。术后2周
              已成为影响移植肾长期存活的主要因素，抑制移植                            内受体小鼠每天通过静脉注射他克莫司（1.5 mg/kg）
              肾间质纤维化形成是改善移植肾长期预后的关键问                            抑制移植后的急性排斥反应。移植术后的第 3 周
              题 。移植肾间质纤维化的共同病理基础为过多细                            开始，受体小鼠每天 IGT（cat：HY⁃17009，20 mg/kg，
                ［1］
              胞外基质在肾间质中异常沉积，而引起细胞外基质合                           MCE 公司，美国）灌胃，持续到 16 周模型建立完成，
              成和分泌的关键效应细胞是肌成纤维细胞 。肌成                            每组 5 只。
                                                    ［2］
              纤维细胞的来源非常复杂，在不同的病理环境中，肌                           1.2.2 小鼠肾功能检测
              成纤维细胞可来源于不同的细胞。目前研究显示在                                 使用肌酐（creatinine，Cr）测定试剂盒（cat：C011⁃
              各种原因引起的肾间质纤维化进程中，肌成纤维细                            2⁃1，南京建成生物工程研究所）和尿素氮（blood
              胞可来源于肾小管上皮细胞、肾微血管内皮细胞、                            urea nitrogen，BUN）测试盒（C013⁃2⁃1，南京建成生物
              成纤维细胞、微血管周细胞及骨髓来源的纤维细                             工程研究所），根据制造商的说明测定小鼠血清 Cr
              胞等  ［3-4］ 。此外，巨噬细胞可以在损伤的肾脏内直                      及血BUN水平。
              接转化为肌成纤维细胞，这个过程被称为巨噬细胞                            1.2.3 细胞培养和处理

              向肌成纤维细胞转分化（macrophage⁃to⁃myofibro⁃                     按既往研究描述的方法从 BALB/c 小鼠股骨与
              blast transition，MMT） ，可能是肾脏从慢性炎症进                胫骨中分离骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow⁃de⁃
                                 ［5-6］
                                                                                       ［13］
              展为致病性纤维化的重要机制。艾拉莫德（igurati⁃                       rived macrophage，BMDM） 。BMDM 在含有10%胎
              mod，IGT）是一种小分子化合物，作为一种新型抗风湿                       牛血清（cat：04⁃001⁃1ACS，BIOIND公司，美国）、1%抗
              药物，在中国和日本被广泛用于治疗类风湿关节炎                            生素（cat：15070063，Gibco公司，美国）和30 ng/mL小
                                    ［7-8］
             （rheumatoid arthritis，RA）  。近期，IGT 被证实可            鼠巨噬细胞集落刺激因子（cat：CB34，苏州Novopro⁃
              通过减少肺部炎症和纤维化以及纤维化相关基因                             tein Scientific 公司）的DMEM培养基中培养。第3天
              的表达，有效缓解肺部纤维化               ［9-11］ ，然而 IGT 对移     更换培养基，第5天将BMDM置于含1% FBS的培养
              植肾间质纤维化的作用不详。本研究通过小鼠肾                             基中培养，并用转化生长因子（transforming growth
              移植模型和体外细胞实验探讨 IGT 对移植肾间质                          factor，TGF）⁃β（5 ng/μL）处理，每 2 d 更换培养基，
              纤维化形成的作用及机制。                                      第 8 天部分细胞加入 IGT（2.5 μg/mL）干预，第 10 天
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                                                                IGT 细胞模型建立完成 ，为 MMT+IGT 组；而未用
              1  材料和方法
                                                                IGT干预细胞为MMT模型，为MMT组。未用TGF⁃β
              1.1  材料                                           刺激细胞为M0组。
                  20~25 g 的雄性野生型 C57BL/6 和 BALB/c 小             1.2.4 蛋白质印迹分析
              鼠购自南京医科大学 SPF 级实验动物中心。实验                               肾脏在冰上用RIPA裂解缓冲液（上海Beyotime
              过程严格遵守南京医科大学动物伦理委员会的规                             公司）裂解以提取总蛋白，提取的蛋白用BCA法测量
              定。所有小鼠在 12 h 光暗周期的房间中饲养，每                         浓度。然后将30~50 μg蛋白样品在10% SDS⁃PAGE
              笼 5 只，自由获取食物和水，环境条件为 20~26 ℃，                     凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
              相对湿度为 40%~60%。所有实验程序均获得南京                         用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h后，4 ℃下孵育一抗

              医科大学动物管理和使用委员会的批准（IACUC⁃                          转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR）抗体（cat：
              2109025）。                                         17435⁃1⁃AP，1∶1 000，Proteintech 公司，美国）过夜。

              1.2  方法                                           然后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000，Protein⁃
              1.2.1 动物模型构建                                      tech公司，美国）孵育，抗体⁃抗原复合物通过ECL底
                  以BALB/c小鼠为受体，C57BL/6小鼠作为供体构                   物检测并在成像系统中可视化。
              建同种异体肾移植模型（CAD组）；以BALB/c小鼠为                       1.2.5 RNA提取及qPCR
              受体，BALB/c小鼠为供体构建同种同体肾移植模型                              从肾组织和原代细胞中分离RNA样品，RNA提
             （SYN组）；每组6只。在移植前，首先将受体小鼠的右                         取使用 TRIzol 试剂（cat：15596026，Invitrogen 公司，
              侧原位肾切除，将供体小鼠的左肾移植到受体小鼠的                           美国）；逆转录使用 HiScript Ⅲ All⁃in⁃one RT Super⁃
              右髂窝处。将供体的肾动脉和肾静脉分别与受体的腹                           Mix Perfect for qPCR（cat：R333⁃01，南京 Vazyme 公
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