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第45卷第5期         杨铖铖，倪    斌，郑 明，等. 艾拉莫德抑制巨噬细胞向肌成纤维细胞转分化减缓慢性移植肾
                  2025年5月               间质纤维化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（5）：619-626                    ·621 ·


                司）；qPCR使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix         表型变化相关的基因功能，基于超几何检验，使用
                进行检测（cat：Q431⁃02，南京Vazyme 公司），每个反                 Phyper对差异基因进行KEGG富集分析，以 Q value≤
                应重复 3 次进行。通过 NCBI 数据库查找人α⁃平滑                      0.05 为阈值，满足此条件的定义为在候选基因中显
                肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle actin，α⁃SMA）、Ⅰ型胶            著富集。
                原蛋白（collagen alpha⁃Ⅰ，ColⅠ）、纤连蛋白（Fibro⁃            1.3  统计学方法
                nectin）和 GAPDH 基因 mRNA 序列，并使 用 Primer⁃                所有数据以均值±标准差（x ± s）表示。使用
                BLAST在线设计PCR引物，由北京擎科生物科技股                         GraphPad Prism 8评估数据。使用两独立样本t检验

                份有限公司合成。引物序列如下：α⁃SMA（上游 5′⁃                       分析两组间差异，单因素方差分析用于多组间差异
                GTCCCAGACATCAGGGAGTAA ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ TCG⁃         分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
                GATACTTCAGCGTCAGGA⁃3′）；ColⅠ（上游 5′⁃GCT⁃
                                                                  2  结 果
                CCTCTTAGGGGCCACT ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ ATTGGGG ⁃
                ACCCTTAGGCCAT⁃3′）；Fibronectin（上游 5′⁃ATGT⁃         2.1  慢性移植肾间质纤维化形成中存在MMT过程
                GGACCCCTCCTGATAGT ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ GCCCAGT⁃             CAD组小鼠出现明显的肾小球硬化、肾小管萎
                GATTTCAGCAAAGG⁃3′）；GAPDH（上游 5′⁃AGGTC⁃             缩、动脉内膜增厚等肾脏纤维化的病理表现（图
                GGTGTGAACGGATTTG⁃3′；下游 5′⁃GGGGTCGTT⁃              1A）。与 SYN 组相比，CAD 组小鼠移植肾间质纤维
                GATGGCAACA⁃3′）。                                   化明显加重，胶原沉积增多，胶原面积明显增加
                1.2.6 组织学和免疫荧光染色                                 （P < 0.001，图1B）；CAD组小鼠血清肌酐、尿素氮等
                    肾移植物用 4%多聚甲醛固定并石蜡包埋。                          指标也显著上升（P < 0.05，图1C、D）。更重要的是，
                5 μm 厚的切片按标准步骤进行苏木精⁃伊红染色                          通过免疫荧光染色，在CAD组小鼠移植肾间质中发
               （hematoxylin⁃eosin，HE）和 Masson 染色。切片用抗             现了同时表达 F4/80（巨噬细胞表面标志物）和α⁃
                F4/80（cat：14⁃4801⁃82，1∶200，Invitrogen公司，美国）       SMA（肌成纤维细胞表面标志物）的细胞（P < 0.001，
                和α⁃SMA（cat：NBP2⁃34 522F，1∶1 000，Novus 公司，         图 1E、F），提示慢性移植肾间质纤维化形成过程中
                美国）的抗体进行免疫染色。切片在 OLYMPUS                          存在显著的MMT过程。
                DP74显微镜下观察。采用Image J软件对Masson染                    2.2  IGT抑制MMT和移植肾间质纤维化形成
                色及免疫荧光染色进行定量分析。Masson 染色定                             Masson 染色结果表明，相比 CAD 组，CAD+IGT
                量分析胶原容积分数，即胶原阳性的蓝色面积与组                            组小鼠移植肾间质纤维化明显改善，胶原面积明显
                织总面积的百分比；免疫荧光染色定量分析相对荧                            减少（P < 0.001，图2A、B）；免疫荧光染色结果发现，
                光强度，即区域荧光强度总和/区域面积。                               CAD+IGT组小鼠移植肾间质中同时表达F4/80和α⁃
                1.2.7 流式细胞术检测                                     SMA 的细胞明显减少，平均荧光强度明显下降（P <
                    收获的细胞制备单细胞悬液，抗体孵育后通过                          0.001，图 2C、D）；RT⁃qPCR 的结果显示，IGT 可显著
                流式细胞术分析。用于细胞表面染色的荧光染料                             降低 CAD 组小鼠α⁃SMA、ColⅠ及 Fibronectin mRNA
                结合抗体有F4/80（cat：14⁃4801⁃82，1∶200，Invitrogen        水平（P < 0.01，图2E~G）。结果表明IGT可显著减缓
                公司，美国）和α⁃SAM（cat：NBP2⁃34 522F，1∶1 000，            慢性移植肾间质纤维化的发生及MMT过程。
                Novus 公司，美国），使用 CytoFLEX 流式细胞仪，数                  2.3  IGT在细胞模型中抑制TGF⁃β诱导的MMT
                据分析使用CytExpert软件进行。                                   为探讨IGT减缓移植肾间质纤维化形成的作用
                1.2.8 酶联免疫吸附实验                                    机制，体外构建MMT细胞模型。流式细胞与免疫荧
                    MMT 细胞模型构建成功后，收集其培养基，                         光染色结果均显示，与M0组相比，MMT组同时表达
                4 ℃ 3 000 r/min 离心10 min去除杂质；取上清，使用               F4/80 和α⁃SMA 的 BMDM 细胞明显增多（P < 0.001，

                ColⅠ酶联免疫吸附试剂盒（cat：RK09065，ABclonal                图 3A~D）；而加入 IGT 干预后，MMT+IGT 组同时表
                公司，美国）测定ColⅠ水平。                                   达 F4/80 和α⁃SMA 的细胞显著减少（P < 0.001，图
                1.2.9 转录组测序                                       3A~D）。收集各组细胞的培养基上清并进行酶联免
                    对 MMT 组和 IGT 组的细胞进行 RNA 提取与纯                  疫吸附实验，IGT 干预减少了 BMDM 细胞上清中
                化收集，测序部分委托深圳华大基因股份有限公司                            ColⅠ的分泌（P < 0.001，图3E）。上述结果提示，IGT
                完成，制备文库，上机测序。为进一步深入探索与                            可在细胞模型中抑制MMT。
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