Page 30 - 南京医科大学自然版
P. 30

第45卷第6期
               ·768 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年6月


              地 塞 米 松（Sigma⁃Aldrich 公 司 ，美 国），γ 干 扰 素           消除残留血清，再加入RPIM⁃1640培养液孵育48 h，
             （interferon⁃γ，IFN⁃γ，上海 Novoprotein 公司），CCK⁃8       收集 M0、M1、M1+BA 组上清液，3 000 r/min 离心
              试剂盒（Apexbio 公司，美国），BA（上海 Macklin 公                10 min，通过0.22 μm过滤器过滤后得到条件培养液。
              司），高纯总 RNA 快速提取试剂盒（上海 Bioteke 公                   1.2.5  CCK⁃8法检测细胞活力
              司 ），Prime Script RT Master Mix 试 剂 盒 、SYBR1            细胞按5 000个/孔密度铺于96孔板，在完全培
              Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa公司，日本），碱性磷                养液中培养 24 h 后，用不同浓度（12.5、25.0、50.0、
                          TM
              酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测试剂盒、BCA             100.0、150.0 μmol/L）的 BA 处理细胞，分别处理 24、
              蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天公司），茜素红                            48、72 h。在各个时间点，加入 100 μL 配制好的
             （alizarin red S，ARS）染色试剂盒（北京 Leagene 公             CCK⁃8溶液，37 ℃孵育2 h。全自动酶联免疫吸附测
              司），IL⁃1β抗体、P62抗体、ALP 抗体（Abcam公司，美                 定仪测定450 nm处的吸光度。
              国），LC3B 抗体、Beclin⁃1 抗体（上海 Abmart 公司）、             1.2.6  免疫荧光染色
              OPN 抗体、GAPDH 抗体（武汉 Proteintech 公司）、                    接种 THP⁃1 细胞悬液于 12 mm 圆形爬片上（1×
              DSPP抗体（Santa Cruz公司，美国）。                          10 个/孔），按前述方法诱导 M1 型极化，加入药物
                                                                  4
              1.2  方法                                           孵育，培养24 h，4%多聚甲醛固定30 min，1% Triton
              1.2.1  牙髓组织获取                                     X⁃100 工作液通透细胞膜 10 min，山羊血清 37 ℃恒
                  选择龋导致的早期慢性牙髓炎病例，无明显急                          温箱内封闭1 h。随后用稀释好的IL⁃1β、iNOS一抗
              性牙髓炎和根尖周炎症状及体征，X 线片显示根周                           在 4 ℃下孵育过夜，再用荧光标记的二抗在室温下
              组织无明显变化，无深牙周袋，去腐未尽即露髓的                            孵育1 h。DAPI染核，LEICA DM4000B显微镜观察
              上颌前牙 1 例，开髓后使用无菌拔髓针完整拔除牙                          处理后细胞的荧光。
              髓，浸泡于4%多聚甲醛中固定备用。收集样本前，                           1.2.7  hDPSC的分离及培养
              向患者充分解释收集样本的目的及用途，并取得患                                 选取本院口腔颌面外科根尖未发育完成的健
              者的知情同意。本研究经南京医科大学口腔医学                             康第三磨牙。用含有 1%青霉素⁃链霉素的 PBS
              院伦理委员会批准（批号：PJ2022⁃204⁃001）。                      冲洗，无菌条件下取出牙髓，超净台内在 200 μL
              1.2.2  苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色             α⁃MEM 培养液中剪碎，加入 500 μL 3 mg/mL Ⅰ型
                  固定后的样本经脱水、透明、石蜡包埋后切片，                         胶原酶和 200 μL 4 mg/mL 胰酶，在 37 ℃、5%CO2条
              脱蜡复水，苏木精染色 5~10 min，盐酸酒精分化、流                      件下消化 20 min。加入完全培养液（含 10%胎牛血
              水返蓝，伊红复染1~3 min，梯度酒精脱水，二甲苯透                       清、1%青霉素⁃链霉素的α⁃MEM 培养液）终止消
              明，中性树胶封片，镜下观察。                                    化。牙髓组织悬液离心弃除上清后，加入5 mL完全
              1.2.3  免疫组化染色                                     培养液，接种于培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中
                  牙髓样品固定后制备石蜡组织块，切片，脱蜡                          培养，每3 d换液。当细胞达到80%融合时，胰蛋白
              脱水后进行免疫染色。在室温下使用 10%山羊血                           酶消化传代。本研究采用生长状态良好的第 3 代
              清封闭1 h，并在4 ℃下将切片与IL⁃1β、iNOS一抗孵                    hDPSC。
              育过夜，随后于室温环境下与二抗共同孵育 1 h，                          1.2.8 hDPSC的处理
              DAB显色，苏木精复染，脱水，中性树胶封片，晾干，                              α⁃MEM 培养液中加入 10% 胎牛血清，并加入
              光学显微镜下观察并记录。                                      50 mmol/L VC、10 mmol/L β⁃GP 和 100 nmol/L 地塞

              1.2.4  THP⁃1的培养和处理                                米松配制成骨诱导培养液。将第 3~5 代的 hDPSC
                  THP⁃1 细胞中加入含 10%胎牛血清的 RPMI⁃                   接种于 6 孔板中，细胞贴壁后更换为条件培养液
              1640 完全培养液，并置于 5%CO2，95%相对湿度的                    （CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA），并加入成骨诱导培

              37 ℃培养箱中培养。用100 ng/mL佛波酯处理THP⁃1                   养液进行矿化诱导，每3 d更换1次培养液。诱导培
              细胞24 h得到M0巨噬细胞（M0组），再加入100 ng/mL                  养7 d后进行ALP染色，21 d后提取总RNA、总蛋白
              LPS 及 20 ng/mL IFN⁃γ 诱导 48 h，使 M0 巨噬细胞极           或进行ARS染色。
              化为M1巨噬细胞（M1组），弃原培养液，加入BA 孵                        1.2.9 实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription⁃
              育24 h（M0+BA组、M1+BA组）。各组巨噬细胞按上                     polymerase chain reaction，RT⁃PCR）
              述方法处理后，弃掉原培养液，PBS冲洗细胞2次以                               收集各组巨噬细胞（M0、M0+BA、M1、M1+BA）
   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35