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第45卷第6期          崔   闯，孙思怡，秦梓一，等. 黄芩苷激活自噬抑制炎症促进牙髓干细胞成牙/骨分化［J］.
                  2025年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（6）：766-776                        ·769 ·


                及 hDPSC 细胞（CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA）。使                后，使用 SYBR1 Premix Ex Taq 试剂盒进行实时
                                                                                              TM
                用高纯总 RNA 快速提取试剂盒并根据说明书所示                          RT⁃PCR，以人 GAPDH 为内参，采用 2          -ΔΔCt 方法进行
                方法提取细胞总RNA 并测定其浓度。 将样品通过                          数据分析，比较各组间基因表达情况。引物序列见
                Prime Script RT Master Mix 试剂盒逆转录成 cDNA           表1。
                                                     表1 RT⁃PCR 使用引物序列
                                                 Table 1 Primer sequences in RT⁃PCR
                                                                Primer sequence（5′→3′）
                      Gene
                                                   Forward                                 Reverse
                     GAPDH              GCACCGTCAAGGCTGAGAAC                     TGGTGAAGACGCCAGTGGA
                     iNOS               CAGGGTGGAAGCGGTAACAAAGG                  CCTGCTTGGTGGCGAAGATGAG
                     IL⁃8               TTTCAGAGACAGCAGAGCACA                    GCCAGCTTGGAAGTCATGTT
                     IL⁃1β              CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA                CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA
                     IL⁃6               CTTCGGTCCAGTTGCCTTCT                     GTGAGTGGCTGTCTGTGTGG
                     RUNX2              ACCTTGACCATAACCGTCTTCAC                  TCCCGAGGTCCATCTACTGTAAC
                     DSPP               TTAAATGCCAGTGGAACCAT                     ATTCCCTTCTCCCTTGTGAC
                     ALP                CCTTGTAGCCAGGCCCATTG                     GGACCATTCCCACGTCTTCAC


                1.2.10 Western blot                              （x ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，
                    从上述处理过的巨噬细胞及 hDPSC 中提取总                       Tukey HSD 法进行事后两两比较。P < 0.05 为差异
                蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量样品蛋白浓                           有统计学意义。
                度。样品经SDS⁃PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜
                                                                  2 结    果
                上，用5%脱脂牛奶在TBST（TBS含0.1% Tween⁃20）中
                封闭 2 h。将膜与相应蛋白（IL⁃1β、LC3B、Beclin⁃1、               2.1  人炎症牙髓组织中炎症因子的表达
                P62、COL⁃1、DSPP、OPN、ALP）一 抗 在 4 ℃ 下 孵                  HE 染色显示，炎症牙髓组织切片可见冠髓炎
                育 过 夜 。 用 抗 兔 或 抗 鼠 二 抗 孵 育 1 h 后 ，使 用            症坏死区域，而根髓部分组织形态未见明显变化，
                ImageQuant LAS4000系统扫描记录，最后使用Image                说明炎症尚未累及根髓。炎症牙髓组织的免疫组
                J软件进行定量分析。                                        织化学染色显示，与健康根髓区域相比，冠髓部分
                1.2.11  ALP染色                                     炎症区周围IL⁃1β的表达明显升高（图1A）。免疫荧
                    向 hDPSC 中加入上述条件培养液（CM⁃M0、                     光染色结果显示，iNOS、IL⁃1β在冠髓炎症区表达升
                CM⁃M1、CM⁃M1+BA）并加入成骨诱导培养液进行矿                      高（图1B、C）。
                化诱导 7 d 后，采用 ALP 检测试剂盒检测 ALP 活                    2.2  THP⁃1细胞活力测定
                性。将细胞浸于4%多聚甲醛中固定30 min，新鲜配                            为了获取最佳 BA 作用浓度，采用 CCK⁃8 方法
                制 BCIP/NBT 染色工作液并加入 6 孔板，每孔 1 mL                  评价 BA 对 THP⁃1 活力的影响。如图 2 所示，12.5、
                并轻轻摇晃充分覆盖细胞，避光染色 5~30 min，每                       25.0、50.0 μmol/L 的BA 处理THP⁃1细胞24、48、72 h
                5 min 检查显色情况。染色完成后用去离子水终止                         后，细胞活性与对照组均无明显差异，表明50 μmol/L
                染色，并用显微镜及扫描仪记录结果。                                 的BA对THP⁃1细胞没有毒性作用，后续研究均采用

                1.2.12  ARS染色                                     该浓度BA处理细胞。
                    各组细胞（CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA）矿化                  2.3  BA降低M1巨噬细胞的炎症水平
                诱导 21 d 后进行 ARS 染色，观察不同处理条件下                          THP⁃1 细胞经诱导处理后，RT⁃PCR 检测相关
                hDPSC 钙盐沉积情况。细胞在 4%多聚甲醛中固定                        炎症基因的表达。BA 对 M0 细胞的各基因表达无
                30 min后使用ARS染色液进行染色，7 min后用去离                     明显影响。与 M0 组相比，M1 组的 IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃6
                子水洗去多余染液，显微镜观察并拍照。                                等相关炎症基因mRNA水平表达升高（图3A）。BA

                1.3  统计学方法                                       （50 μmol/L）孵育 24 h 后，IL⁃1β、IL⁃8 的 mRNA 水
                    使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析。                平明显下降，而 IL⁃6 的表达水平较 M1 组差异无
                每个实验均独立重复3次，定量数据以均数±标准差                           统计学意义。免疫荧光染色及 Western blot 检测
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