Page 63 - 《南京医科大学学报》2026年第1期

第46卷第1期 马 金，沈 滟，沈国民，等. F9基因剪接位点共识区域中内含子突变造成的异常剪接模式
2026年1月 研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（1）：55-67 · 57 ·

种密度维持在1×10 个/mL。
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1 材料和方法
1.2.3 质粒构建
1.1 材料 微型基因剪接实验载体构建方法如下：通过
实验所用人胚肾细胞HEK⁃293T由本实验室保 FastCloning技术将F9基因外显子4及其两端侧翼序
存，细胞培养使用 DMEM 培养基（Corning 公司，美 列（约 450 bp）克隆至 pSPL3 载体的多克隆位点内
国）和Optimal⁃MEM培养基（Gibco公司，美国），并添 （Xho Ⅰ和 BamH Ⅰ）构建野生型（wild type，WT）剪
加 10%胎牛血清（上海 ABW 公司）及 1%青霉素⁃链 接报告载体。随后，针对不同突变位点设计相应引
霉 素 溶 液（北 京 Coolaber 公 司）；细 胞 消 化 采 用 物（表 1），构建突变型剪接报告载体。体外表达载
0.25%胰酶⁃EDTA（北京 Coolaber 公司）。质粒提取 体以 pBudCE4.1 载体为骨架，将 F9 基因 cDNA 序列

使用小提中量质粒提取试剂盒、DNA纯化采用DNA 插入到载体的多克隆位点内构建 WT FⅨ表达载
纯化试剂盒（北京天根生物公司）。细胞转染采用 体。分析异常剪接突变体的编码序列，针对具有编
PEI 转染试剂（Polyscience 公司，美国），RNA 提取使 码功能的突变体，设计相应引物（表2），以WT表达载

用 RNA 提取试剂盒、cDNA 合成采用 Hiscript Ⅲ RT 体为模板通过FastCloning技术构建异常剪接突变体
SuperMix 试剂盒、PCR 扩增使用 2× Taq Master Mix 的体外表达载体。所有载体均经过Sanger测序验证。
（南京诺唯赞公司）。克隆实验采用 pMD18⁃T 载体 1.2.4 细胞转染
试剂盒（Takara 公司，日本）。蛋白印迹实验使用 将处于对数生长期的 HEK⁃293T 细胞接种于
0.2 μm PVDF 膜（Millipore 公司，美国），一抗为羊抗 6 孔板中，待细胞汇合度达70%时，采用聚乙烯亚胺
人 FⅨ单克隆抗体（Affinity Biologicals 公司，加拿 （polyetherimide，PEI）转染试剂进行瞬时转染。转染
大），二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体 体系如下：6 孔板每孔转染 DNA 量为 4 μg，DNA 与
（Proteintech 公司，美国），内参采用β⁃actin⁃HRP PEI 的比例为 1∶3，DNA 与 PEI 稀释采用优化的无
（Santa Cruz公司，美国）。凝血功能检测使用活化部分 血清培养基（Optimal⁃MEM），转染 4~6 h 后用含有
凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time， 10 μmol/L维生素K的完全细胞培养液继续培养36~
APTT）试剂和FⅨ缺陷血浆（西门子公司，德国），并 48 h。
以质控血浆（Hyphen BioMed公司，法国）作为对照。 1.2.5 样品制备
实验所需引物及Sanger测序由天津金唯智生物公司完 细胞培养完成后收集细胞样品用于细胞总
成，毛细管电泳委托上海生工生物工程有限公司完成。 RNA 和蛋白提取。根据试剂生产商提供的操作指
1.2 方法 南进行细胞总RNA抽提，抽提完毕后利用紫外分光
1.2.1 计算机预测分析 光度计测定RNA的浓度和纯度，确保抽提样本无基
本研究采用多种生物信息学工具对 F9 基因的 因组 DNA 和有机试剂污染，以保证后续实验效果。
剪接位点进行系统性分析。首先，利用 WebLogo 对 胞内蛋白提取前先用 PBS 缓冲液洗涤细胞，后加入
F9基因供体端和受体端的序列进行可视化分析，以 细胞裂解液，待其充分裂解后离心收集上清液作为
评估其保守性特征。随后，使用 Human Splicing 胞内蛋白样本待用。分泌蛋白样品提取时收集细
Finder（HSF）和 MaxEntScan（MES）两种不同的算法 胞培养液，若样本用于 Western blot 分析，采用三氯
工具对外显子4的经典剪接位点及潜在隐性剪接位 乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀法提取；若分泌
点进行评分。为全面评估突变对剪接模式的影响， 蛋白样品用于体外凝血活性检测，则采用超滤管进

研究进一步整合了罕见病数据中心（rare disease data 行浓缩法收集（注意：为避免细胞培养液中血清的
center，RDDC）数据库的预测结果。本研究涉及的 影响，收集分泌蛋白样本时需要用 Optimal⁃MEM 进
致病突变及临床相关信息均来源于 FⅨ突变数据 行细胞培养）。
库，确保了数据的可靠性和准确性。 1.2.6 剪接模式分析
1.2.2 细胞培养 采用Hiscript Ⅲ RT SuperMix kit将1 μg总RNA

含10%胎牛血清和1%青霉素⁃链霉素的DMEM 反转录为 cDNA，随后使用 2×Taq Master Mix 进行
高糖培养基对 HEK⁃293T 细胞进行培养，恒温培养 PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变
箱设置温度和CO2浓度分别为37 ℃、5%。细胞汇合 性 15 s、57 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，共 25 个循
度达到90%及以上时，进行细胞传代，传代时细胞接 环；72 ℃终延伸 5 min。2%琼脂糖凝胶电泳观察条