Page 68 - 《南京医科大学学报》2026年第1期

第46卷第1期
· 62 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年1月

物，电泳图上显示这些突变可能完全导致外显子 4 2.4 Sanger测序揭示特异性剪接模式
的跳跃（258 bp），证实了剪接位点突变对pre⁃mRNA 为精确解析突变诱导的异常剪接模式，本研究
剪接模式的显著影响（图3B）。 对PCR扩增产物进行纯化并克隆至pMD18⁃T载体，

A
c.391+2T>A/C
c.278⁃2A>T c.391+5G>A/delG
c.391+1G>T/A/C/ins T
c.278⁃3A>G c.278⁃1G>T/C/A c.391delG c.391+7A>G
Intron 3 Exon 4 Intron 4

440 bp 446 bp
XhoⅠ 114 bp BamHⅠ
Intron 3 Intron 4
SD6 SA2
Splice donor MCS Splice accepter
pSPL3 plasmid

SV40 promoter Amp gene SV40 LPAS

B
Acceptor site Donor site
c.391+1G>A
c.391+5delG
c.391+7A>G
c.391+2T>A
c.391+1insT
c.278⁃1G>C
c.278⁃2A>T
c.391delG
PSPL3 c.278⁃1G>T c.278⁃1G>A c.278⁃3A>G c.391+1G>T c.391+1G>C c.391+2T>C c.391+5G>A
bp M WT
2 000
1 000
750
500
372 bp SD Exon 4 SA Normal splicing
250 258 bp
SD SA Exon 4 skipping
100
A：Schematic diagram of minigene splicing detection vector and target variants. SD6 and SA2 are amplification primers，and arrows indicate PCR
amplification directions. The position of the site⁃directed variant is shown above. B：Agarose gel electrophoresis of in vitro splicing assays for exon 4.
The pSPL3 vector was used as a negative control，and its splicing product did not contain exon 4. The WT vector served as a positive control，and its ma⁃
ture transcript contained exon 4，showing normal splicing.
图3 突变对pre⁃mRNA剪接的影响
Figure 3 Effects of variants on pre⁃mRNA splicing

经转化、菌落PCR 筛选后进行Sanger 测序检验。结 c.391delG和c.391+1insT虽然破坏了经典剪接位点，
果显示，除外显子4跳跃外，还鉴定出另外两种异常 但是相对内含子来说仍然遵从原有切割位点，提
剪接转录本：①外显子4末端缺失96 nt的异常剪接 示-1G在剪接调控中的作用有限，剪接体主要识别供
转录本；②内含子 3 受体端 2 nt 保留的异常剪接转 体位点的内含子序列。c.391+5G>A和c.391+5delG

录本（图 4A）。深入分析表明，c.278⁃1G>T、c.278⁃ 作为内含子低保守性位点突变，同样导致外显子跳
1G>C、c.278⁃1G>A和c.278⁃2A>T突变通过破坏经典 跃，证明了非保守位点的突变对剪接调控的重要影

剪接供体位点导致外显子4跳跃，同时激活外显子4 响 。 其 余 5 个 突 变（c.391 + 1G>T、c.391 + 1G>A、
内的隐性剪接供体位点，产生部分外显子 4 末端缺 c.391+1G>C、c.391+2T>A、c.391+2T>C）均通过破坏
失96 nt的转录本。值得注意的是，c.278⁃3A>G突变 内含子保守位点导致外显子 4 跳跃。值得注意的
导致内含子3受体端2 nt的保留，形成移码突变，其 是，c.391+7A>G是唯一未影响剪接的突变，提示该位
机制可能与 c.278⁃3A>G 突变后与-4 位 A 组成受体 点相对较高的保守性可能与其功能冗余有关。通过
端高保守性“AG”序列有关。对于供体端突变， 对比这些突变的体外剪接模式与预测结果（表4），发