Page 66 - 《南京医科大学学报》2026年第1期

第46卷第1期
· 60 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年1月

2.2 基于生物信息学评估突变对pre⁃mRNA剪接的 剪接位点在基因上的位置信息如图2所示。评分结
影响 果显示，WT剪接受体序列的评分分别为78.35（HSF）
随着生物信息学算法的不断发展，本研究采用 和 5.14（MES），显著低于其他两个隐性剪接受体，
两种不同算法工具（HSF和MES）对外显子4及其侧 而 WT 剪接供体序列的评分分别为 98.49（HSF）和
翼序列潜在的剪接位点进行系统评估，其中预测的各 9.66（MES），明显高于隐性剪接供体（表3）。这一发

Donor 2
93.78/8.94（skip）
agcctaaggatctttgtttgggtggcttttagaaactcaggaagacaggagcatcatatgcctataggcagctggcttccaggtcagtagttttgctctgaccctaaaat
c.278
cagactcccatcccaatgagtatctacaggggaggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagATGGAGATCAGTGTGA
WT acceptor Donor 4
78.35/5.14 80.4/6.96（del 102 nt）
GTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAA
Acceptor 3
81.29/6.07（del 96 nt）
c.391
CTGTGAATTAGgtaagtaactattttttgaatactcatggttcaaagtttccctctgaaacaagttgaaactggaaaatgcaatattggtgtatcataatttttcttaaaa
WT donor
98.49/9.66
acatacctttgatgcttataaacatttcatttgtagtgatagttttcaggatatgagttcaagaagctacattaaaatcaataacaatatttggtaacta
Acceptor 2 Donor 3
86.05/6.37（skip） 82.72/4.27（ins 193 nt）
The picture shows exon 4 and the sequences of the intron upstream and downstream of it. Capital letters represent exon，and lowercase letters repre⁃
sent intron. Predicted splice site sequences are shown in italics，with splice donors in blue and splice acceptors in red.
图2 生物信息学工具预测的剪接位点分布
Figure 2 Splice site distribution predicted by bioinformatics tools

表3 生物信息学工具预测的剪接位点评分 会影响 pre⁃mRNA 剪接。进一步分析表明，这些突
Table 3 Splice site score predicted by bioinformatics tools 变可能通过以下机制导致剪接异常：破坏经典剪接
Site Splice site sequence HSF MES 位点；激活隐性剪接位点；创建新的剪接位点。具
Accepter WT cctatctcaaagAT 78.35 5.14 体预测结果详见表4。
Accepter 1 tttcatttgtagTG 86.05 6.37
2.3 微型基因检测载体的构建及剪接分析
Accepter 2 ttggatttgaagGA 81.29 6.07
为验证计算机预测结果的真实性，本研究建立
Donor WT TAGgtaagt 98.49 9.66
了微基因剪接报告载体。首先，将外显子 4 及其侧
Donor 1 CAGgtcagt 93.78 8.94
翼序列（内含子 3 和内含子 4，各约 450 bp）克隆至
Donor 2 TTGgtaact 82.72 4.27
pSPL3载体中，Sanger测序验证WT载体构建的正确
Donor 3 AGTgtgagt 80.4 6.96
性（图3A）。随后，利用特异性引物和FastCloning技
The scoring range for HSF is zero to 100，The scoring range for
术构建 15 个突变型载体。将构建成功的载体分别
MES is zero to 10.
转染 293T 细胞中，培养 48 h 后提取总 RNA，经反转
现提示，内含子 3 的剪接受体可能存在选择性剪接 录后进行 PCR 扩增，最后通过 2%琼脂糖凝胶电泳
倾向，核苷酸替换可能通过改变剪接调控元件的结 分析剪接产物。实验设置 pSPL3 载体作为阴性对
合特性而影响剪接模式。本研究中 15 个致病突变 照，其剪接产物不包含外显子4，为258 bp，WT载体
均 位 于 剪 接 位 点 共 识 区 域 内 ，其 中 13 个 突 变 作为阳性对照，其成熟转录本中包含外显子4，预期
（86.7%）与中度、重度 HB 相关，3 个突变（20.0%）呈 为372 bp。

现显著的表型异质性。通过整合HSF、MES和RDDC 剪接分析结果显示，c.278⁃3A>G和c.391+7A>G
这3种工具对临床15个突变的剪接预测结果，发现 突变产生的剪接产物与WT大小相似（372 bp），提示
除c.391+7A>G外，其余14个变异（93.3%）均被预测 这两个突变可能不影响pre⁃mRNA的正常剪接。然