Page 71 - 《南京医科大学学报》2026年第1期
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第46卷第1期         马 金，沈     滟，沈国民，等. F9基因剪接位点共识区域中内含子突变造成的异常剪接模式
                  2026年1月                   研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（1）：55-67                    · 65   ·


                0.01）。在分泌水平上，p.D93⁃G125delinsG显著降低
                                                                  3  讨 论
               （P < 0.001），而 p.G94 ⁃ D131del 无 明 显 变 化（ 图
                6B）。为进一步评估突变型FⅨ的功能，采用超滤浓                              近年来，随着HB诊疗水平的提高，大量致病突
                缩管浓缩上清液蛋白样本，按照标准操作流程测定                            变被相继发现 。这些致病突变是研究蛋白功能、
                                                                               ［9］
                凝血活性。结果显示，两种突变型 FⅨ的体外凝血                           探究疾病发病机制的重要工具。编码区突变作为
                活性均显著低于 WT FⅨ（P < 0.001，图 6C）。这些                  疾病产生的主要原因之一，已被广泛研究                    ［8，22］ 。然
                发现不仅证实了剪接位点突变对FⅨ蛋白表达和功                            而，除编码区之外，非编码区的突变同样可导致疾
                能的显著影响，也为理解 HB 发病机制提供了重要                          病产生   ［13］ 。目前，针对突变效应，多采用生物信息
                的实验依据。                                            学预测其对pre⁃mRNA剪接的影响            ［23-26］ ，但是现阶段


                  A                                    B      1.20                       C      1.20
                                p. D93⁃G125delinsG  p. G94⁃D131del  Relative antigen  expression of FIX  1.00  **  ***  **  Relative antigen  expression of FIX 1.00
                                                                                                0.80
                                                              0.80
                                                                                                0.60
                                                              0.60
                                                                                                0.40
                             WT                               0.40                              0.20
                                                                                                0.10
                                    -100 kDa                  0.20
                                                                                                0.05   ***  ***
                                    -72 kDa  Secreted protein
                     Anti⁃FIX                                   0                                 0
                                    -55 kDa
                                    -43 kDa                         WT       WT                       WT
                                    -72 kDa
                                    -55 kDa                               p. G94⁃D131del  p. G94⁃D131del    p. G94⁃D131del
                     Anti⁃FIX                                          p. D93⁃G125delinsG  p. D93⁃G125delinsG  p. D93⁃G125delinsG
                                    -43 kDa
                                           Cell lysate
                                    -55 kDa
                   Anti⁃β⁃actin     -43 kDa
                                    -33 kDa
                                                                    Cell lysate  Secreted protein
                   A，B：Relative expression and secretion of FⅨ antigen from two aberrant splicing expression vectors（p.D93⁃G125delinsG and p.G94⁃D131del）in
                                                                         **
                293T cells. C：Relative coagulation activity of aberrant splicing expression vector antigens. P < 0.01 and  *** P < 0.001.
                                           图6 异常剪接转录本的体外FⅨ抗原表达及活性分析
                           Figure 6 In vitro analysis of FⅨ antigen expression and activity for aberrant splicing transcripts

                生物信息学预测结果的可靠性仍有待验证。因此                             c.391+2T>C等）通过削弱经典剪接位点识别导致外
                对内含子中突变的确切剪接模式进行研究不仅有                             显子跳跃，其他突变（如 c.278⁃1G>T、c.278⁃1G>C、
                利于分析不同突变确切的致病机制，更为生物信息                            c.278⁃1G>A 等）通过增强隐性剪接位点利用，引起
                学预测提供理论依据以提高预测的准确性。据                              部分外显子4末端96 nt的缺失，c.278⁃3A>G通过创
                此，本研究通过序列分析确认 F9 基因剪接位点的                          建新的剪接位点造成内含子 3 受体端 2 nt 保留，值
                保守序列特征，认为剪接位点及其侧翼序列的突                             得关注的是，单纯基于GT⁃AG序列保守性无法准确
                变可能通过影响剪接调控而干扰 pre⁃mRNA 的正                        预测具体剪接模式。例如：低保守核苷酸位点突变
                常加工过程。随后，通过查找内含子中致病突变                            （如c.391+5G>A和c.391+5delG）显著破坏经典剪接
                的定位，一共筛选了 15 个可能影响 F9 基因外显子                       位点，导致外显子 4 跳跃，而高保守剪接位点突变
                4 正常剪接的靶突变，并联合微型基因剪接和变性                          （如 c.391+1insT 和 c.391delG）相对内含子来说是正
                毛细管电泳等方法对上述突变的具体剪接模式进                             常剪接，这一发现挑战了传统的剪接调控认知，丰
                行分析。                                              富了对剪接调控复杂性的认识。
                    通过比对分析不同突变位点保守性及引起的                               目前，剪接位点选择的分子机制尚未完全阐
                剪接模式差异，本研究发现内含子中剪接共识区间                            明，实际剪接序列的多样性源于多种蛋白质（如SR、
                内的核苷酸突变可通过多种机制影响pre⁃mRNA剪                         hnRNP 等）的协同作用来实现对剪接事件的精细调
                接：①削弱经典剪接位点识别；②增强隐性剪接位                            控 ［27-29］ ，这种复杂性使得特定剪接模式的精准预测
                点的利用；③创建新的剪接位点。部分突变（如                             极具挑战。本研究还强调了拓展致病突变分类框
                c.391+1G>T、c.391+1G>A、c.391+1G>C、c.391+2T>A、      架的重要性，传统观点认为遗传信息遵循中心法
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