Page 65 - 《南京医科大学学报》2026年第1期

第46卷第1期 马 金，沈 滟，沈国民，等. F9基因剪接位点共识区域中内含子突变造成的异常剪接模式
2026年1月 研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（1）：55-67 · 59 ·

5×上样缓冲液（含β⁃巯基乙醇）按适当比例混合， 性和可靠性。
100 ℃煮沸 5 min 后上样。使用 10% SDS⁃PAGE 凝 1.3 统计学方法
胶进行蛋白分离，随后采用湿转法将蛋白转移至 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析及
0.2 μm 硝酸纤维素膜上，用 5%脱脂牛奶室温封闭 绘图。所有实验均独立重复3次。组间数据比较采
2 h，分别加入1∶10 000稀释的羊抗人FⅨ单克隆抗 用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
体或 1∶20 000 稀释的β⁃actin⁃HRP，4 ℃孵育过夜。
2 结 果
次日，用 TBST 缓冲液（0.1% Tween⁃20）洗涤 3 次，每
次 15 min；随后加入 1∶10 000 稀释的辣根过氧化物 2.1 F9基因剪接位点保守序列的特征分析

酶标记的兔抗羊 IgG 二抗，室温孵育 50 min。TBST F9 基因全长 33.5 kb，由 8 个外显子和 7 个内含
再次洗涤后，使用ECL化学发光试剂在化学发光成 子组成。利用 WebLogo 在线生物信息学工具对其
像系统上进行显影。采用 Image J 软件对蛋白条带 供体和受体端进行保守性分析（图1A、B），结果显示
进行灰度值分析，所有实验均独立重复3次以确保结 除了高度保守的GT⁃AG剪接位点外，剪接供体位点
果的可重复性。 的-1 位 G 和+7 位 A 以及剪接受体位点的-6 位 T 也
1.2.8 FⅨ凝血活性测定 呈现显著保守特征，两侧其他序列保守性相对较
采用凝固法测定FⅨ凝血活性（FⅨ：C）。首先， 低。这一发现提示，剪接位点核心区域以外的突变
将标准血浆按 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、 也可能干扰pre⁃mRNA的正常剪接。
1∶320 的梯度比例进行稀释，制备标准曲线。实验 本研究通过收集FⅨ突变数据库中所有内含子
样本按体积比1∶5或1∶10用缓冲液稀释，必要时根 区突变信息，通过统计发现，可能影响外显子4精确
据样本活性调整稀释比例。使用半自动凝血分析 剪接的突变在发生频率和临床关联性上均占主导
仪进行检测，以APTT试剂和FⅨ缺陷血浆作为检测 地位。因此，本研究以外显子4的剪接调控为范例，
体系，记录血浆凝固时间。将待测样本的凝固时间 重点分析内含子 3 剪接受体位点上的 5 个突变、内
代入标准曲线，计算FⅨ：C活性。每个样本平行测 含子 4 剪接供体位点上的 10 个突变，图 1C 展示了
定3次，取平均值作为最终结果，以确保数据的准确 15个靶突变的信息、患者的表型和数量。

A Acceptor B
3 3 Donor

Bits 2 Bits 2
1 1

0 0
-26 -25 -24 -23 -22 -21 -21 -19 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5 +6 +7
C
c.278 c.391
Intron 3 -3-2-1 Exon 4 +1+2+3 +5 +7 Intron 4
. . .tgccaattcaatttcttaacctatctcaaag ATGGAGATCA...TGAATTAG gtaagtaactattttttgaatactcatggttc. . .

G T T/C/A delG T/C/A/insT A/C A/delG G
1Mo
7S 6S 3Mo 3Mo NA 5S
2S 2S 1S 1Mo
1Mo NA 2Mo
2S 1S 1Mo
1Mo
A，B：Conservative analysis of acceptor（A）and donor（B）sequences of F9 gene. The horizontal axis represents the base position，and the vertical
axis represents the information entropy. The height of each letter represents the conservatism and variability of the base at that position. The higher the
information entropy（lower conservation），the smaller the symbol height；the lower the information entropy（high conservatism），the greater the symbol
height. C：Schematic diagram of base variants distribution and patient information. Intronic and exonic sequences are represented by lowercase and up⁃
percase letters，respectively. S：severe；Mo：moderate；NA：no available data.
图1 基于F9基因剪接位点序列保守性筛选的15个目标突变
Figure 1 Fifteen target variants were screened based on sequence conservation of F9 splice sites