Page 34 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期
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第46卷第2期
               ·190 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年2月


              1.1.3  仪器与设备                                      使用。
                  超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限                               使用透射电子显微镜（transmission electron mi⁃
              公司）；流式细胞仪、超速离心机（Beckman 公司，美                      croscopy，TEM）观察外泌体的形态特征。通过纳米
              国）；透射电子显微镜（FEI 公司，美国）；超低温冰箱                       颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）
             （三洋公司，日本）；二氧化碳培养箱、高速冷冻离心                           测量外泌体的粒径和浓度。通过蛋白质印迹分析
              机（Thermo Fisher公司，美国）。                            外泌体上表面标志物CD9、CD63、TSG101和Calnexin
              1.2  方法                                           的表达。
              1.2.1  hESC和hAMSC的体外培养                            1.2.4  RNA提取及测序
                  hESC 由原先的 mTeSR 培养体系更换为成分明                         外泌体 RNA 纯化试剂盒从 hESC 和 hAMSC 男
              确且无血清和无饲养层的ncEpic 培养系统，并在涂                        性 及 女 性 细 胞 株 系 的 外 泌 体 中 提 取 和 纯 化 总

              有基质胶（Matrigel）的培养皿中生长，在 37 ℃、5%                   RNA。 使 用 Agilent Bioanalyzer 2100 系 统 和 RNA
              CO2的培养箱中培养。每天更换培养基，当细胞汇                           Nano 6000 检测试剂盒对 RNA 浓度和纯度进行评
              合约 85%时，收集培养上清液，使用解离缓冲液消                          估。遵循制造商的建议，使用SMARTer全链RNA序
              化细胞，并在基质胶包被板上的ncEpic 培养基中作                        列试剂盒 V2 高效制备文库，并使用 QIAseq miRNA
              为团块传代。                                            文库试剂盒生成文库。最后，通过Agilent Bioanalyzer
                  hAMSC使用含有93.87% α⁃MEM、5% UltraGRO、            2100和qPCR评估文库质量。使用TruSeq PE Cluster
              1% L⁃谷氨酰胺溶液和0.03%肝素钠的完全培养基，                       Kitv3⁃cBot⁃HS 在 acBot 集群生成系统上对索引编码
              在 37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养，细胞汇合度为                       样品进行聚类，然后，在Illumina NovaSeq 6000平台上
              70%~80%时，更换为含有 98.3% α⁃MEM、1.1% L⁃谷               对文库制备物进行测序，并生成配对末端读数                     ［21-22］ 。
              氨酰胺溶液和 0.59% MSC NutriStem XF supplement          1.2.5  RNA差异表达分析
              的无外泌体培养基，继续培养 24 h 后，收集培养上                             miRNA的测序读数使用指定的基因组GRCH38
              清液。                                               作为参考进行序列比对及后续分析                  ［23］ 。miRNA 注
              1.2.2  hESC和hAMSC的鉴定                              释文件来自miRBase，利用miRDeep2软件进行已知
                  hESC的鉴定主要通过形态学鉴定：显微镜下观                        及新的miRNA鉴定，Bowtie用于miRNA文库测序数
              察细胞形态变化；免疫学鉴定：免疫荧光染色检测                            据的比对。本研究中，采用 edgeR 软件进行差异筛
              hESC表面标志物的表达；流式细胞术：评估hESC的                        选，将差异倍数（fold change，FC）≥1.5且P < 0.05 作
              多能性标志物 NANOG、OCT4、SSEA4、TRA⁃1⁃60 的                为筛选标准。
              表达，采用FlowJo软件进行实验数据分析。                            1.2.6  液相色谱⁃串联质谱（liquid chromatography⁃
                  hAMSC的鉴定主要通过形态学鉴定：显微镜下                        tandem mass spectrometry，LC⁃MS/MS）分析
              观察细胞形态变化；功能鉴定：在成骨、成脂和成软                                从外泌体提取总蛋白，并使用 Bradford 方法对
              骨分化培养基中培养诱导 hAMSC 分化，通过茜素                         样品进行蛋白浓度测定。提取好的外泌体采用质
              红、油红O 和阿利辛蓝染色证实；流式细胞术：进行                          谱检测适配的外泌体裂解液裂解，胰蛋白酶消化蛋
              hAMSC表型分析，并测定表达间充质标志物CD73、                        白质过夜，之后使用脱盐柱进行脱盐。将肽段样本
              CD90、CD105、CD44、CD11b、CD19、CD34、CD45 和            用 0.1%甲酸复溶，使用纳升流速 Easy⁃nLC 1200 色
              HLA⁃DR的细胞的百分比。                                    谱系统进行色谱分离。肽段分离后用 QE HF⁃X 质

              1.2.3  外泌体的分离和鉴定                                  谱仪进行DIA质谱分析。
                  当细胞约 85%融合时收集 300 mL 细胞上清液                         质谱检测得到的数据采用Spectronaut18软件进
              用于外泌体纯化。所有离心步骤都在 4 ℃下进行。                          行搜库检索。通过蛋白质负载对数据进行归一化
              将上清液进行梯度离心（300 g 离心 10 min，2 000 g                并校正差异 P 值错误发现率（false discovery rate，
              离心 20 min，12 000 g 离心 30 min）以分离细胞碎               FDR）后，差异表达蛋白（differentially expressed protein，
              片。使用0.22 μm过滤器进行过滤。使用Ti70转子                       DEP）被认为是有效的。本研究中，显著差异蛋白筛

              将滤液以120 000 g离心3 h，然后将它们重悬于PBS                    选阈值为FC≥1.5或FC≤1/1.5，且P < 0.05。
              中，再次以 120 000 g 进行超速离心 3 h。将最终的                   1.2.7 生物信息学分析
              外泌体颗粒重悬在 PBS 中，并在-80 ℃下储存直至                            采用R包clusterProfiler对原始数据进行生物信
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