Page 35 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期
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第46卷第2期      黄蓓蓓，宁     松，吴慧敏，等. 不同性别来源人胚胎干细胞与羊膜间充质干细胞外泌体蛋白质组学与
                  2026年2月              miRNA谱分析［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（2）：188-201                  ·191 ·


                息学分析。基因本体论（gene ontology，GO）分析用                   的尺寸分布在 50~200 nm，hESC⁃exo 女株平均粒径
                来评估差异表达基因在特定生物过程中的潜在富集。                          （130.63±36.32）nm，男株平均粒径（192.0±8.57）nm，
                京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia                   hESC⁃exo 平均男株粒径比女株粒径大；hAMSC⁃exo
                of Genes and Genomes，KEGG）是系统分析基因功                女株粒径（147.07±3.29）nm，男株粒径（148.50±2.33）
                能、基因组信息数据库，有助于将基因及表达信息                            nm（图 2B）。蛋白印迹表明，分离的外泌体携带阳
                作为一个整体网络进行研究。富集分析采用超几                             性标记 CD9、CD63 和 TSG101，但不携带阴性标记
                何分布的算法进行显著性检验计算 P 值，并通过基                          Calnexin（图 2C）。尽管 hESC 女株的外泌体产量高
                于多重假设检验的FDR进行P值校正，计算Q值，以                          于男株，但总体而言，hAMSC 的外泌体产量比hESC
                确定统计显著性。                                          的外泌体产量高（图2D）。

                1.3  统计学方法                                        2.3 hESC⁃exo和hAMSC⁃exo蛋白质和miRNA的质检
                    本研究中的相关实验均进行了3次独立生物学                              从男性和女性 hESC⁃exo 和 hAMSC⁃exo 提取蛋
                重复。GraphPad Prism 9 软件用于分析实验数据和                   白质和 RNA 进行蛋白质组学和 miRNA 测序。皮尔
                绘制统计图，计量资料以均值±标准差（x ± s）的形式                       逊图证明了相同细胞来源的外泌体之间的高度相
                表示。数据比较采用双尾t检验分析，P < 0.05时为                       关性（图 3A）。PCA 用于定量评估蛋白质和 miRNA
                差异有统计学意义。                                         的可重复性（图 3B、C）。蛋白质定量分析显示，
                                                                  hAMSC⁃exo 的蛋白质浓度高于 hESC⁃exo（图 3D）。
                2 结    果
                                                                  RNA浓度的测定显示，hAMSC⁃exo 与hESC⁃exo之间
                2.1  hESC和hAMSC的鉴定                                差异无统计学意义（图3E）。
                    无饲养层系统培养的hESC从mTeSR 培养体系                      2.4  男女株hESC⁃exo和hAMSC⁃exo蛋白质组特征
                转换至 ncEpic 培养体系，通过流式细胞术对 hESC                     2.4.1  hESC⁃exo男株与女株的比较
                的多能性进行跟踪鉴定。经过几次传代培养，hESC                              男女株hESC⁃exo蛋白质组分析发现330个差异
                状态稳定，如图1A所示，hESC克隆团内部细胞排列                         表达蛋白质（图 4A）。热图分析显示男株 hESC⁃exo
                紧密，分布均匀，边缘完整。免疫荧光表明hESC 在                        （簇 1）中上调蛋白主要富集于新冠、系统性红斑狼
                细胞膜表达 TRA⁃1⁃60 和 SSEA4，细胞核中表达                     疮、酒精依赖症；女株hESC⁃exo（簇2）中上调蛋白主
                NANOG 和 OCT4（图 1B）。进一步的流式细胞术显                     要参与补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感
                示这些多能性相关标志物（NANOG、OCT4、SSEA4、                     染、蛋白质消化与吸收、胆固醇代谢、类风湿性关节
                TRA⁃1⁃60）的阳性率均高于95%（图1D）。男性细胞                     炎（图4B）。
                株和女性细胞株表征一致，符合多能性干细胞的标                                构建维恩图识别男株和女株之间独特和重叠
                准，可用于后续实验。                                        的蛋白质编码基因簇。女株hESC⁃exo和男株hESC⁃
                    hAMSC生长呈梭形，并显示成纤维细胞样形态                        exo 分别有 44 个和 950 个特异表达蛋白，同时存在
               （图1A）。体外能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞                           2 678个共享蛋白（图4C）。
                和软骨细胞（图 1C）。通过流式细胞术鉴定 hAMSC                           对男女株 hESC⁃exo 特异表达蛋白进行 KEGG
                特异性表面标志物（图 1E），结果显示细胞高表达                          富集分析。结果表明，女株hESC⁃exo特异表达蛋白
                CD73、CD90、CD105 和 CD44，而不表达或极低表达                  显著富集于疟疾、非洲锥虫病、PI3K⁃Akt 信号通路、
                CD19、CD34、CD45、CD11b 和主要组织相容性蛋白                   黏着斑形成等通路（图 4D）。男株 hESC⁃exo 特异表
                HLA⁃DR。男性细胞株和女性细胞株表征一致，这                          达蛋白显著富集于剪接体、mRNA监测途径、核质转
                些结果证实了制备的hAMSC可以用于下游实验。                           运、DNA 复制等通路（图 4E）。男女株 hESC⁃exo 共

                2.2  hESC⁃exo和hAMSC⁃exo的分离与鉴定                     享蛋白显著富集于蛋白酶体、核质运输、内质网蛋
                    为探讨不同性别干细胞外泌体是否存在功能                           白质加工、肌肉细胞骨架、黏着斑、内吞作用、溶酶
                差异，分别从 hESC 和 hAMSC 的男性细胞株和女性                     体、核糖体等通路（图4F）。上述通路主要与细胞周
                细胞株的条件培养基中分离出外泌体，并根据形                             期及代谢调控相关。
                态、粒径、浓度和表面标记进行鉴定。透射电镜显                            2.4.2 hAMSC⁃exo男株与女株的比较
                示这些外泌体呈“茶托状”形态，不同干细胞来源的                               男女株 hAMSC⁃exo 蛋白质组测序发现 81 个差
                外泌体之间没有形状差异（图 2A）。NTA 显示它们                        异表达蛋白质（图5A）。相比hESC⁃exo，hAMSC⁃exo
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