Page 32 - 南京医科大学自然版
P. 32

第46卷第5期
              ·654 ·                             南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年5月


                                                                     实时荧光定量PCR相关试剂：细胞总RNA提取
              1  材料和方法
                                                                试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），5×Primer
              1.1  材料                                           Script RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq 试剂
              1.1.1 临床标本                                       （TAKARA公司，日本）。
                  患者来源的胃癌组织以南京医科大学第一附                                流 式 细 胞 术 相 关 试 剂 ：Fixable Viability Dye
              属医院采集。所有癌组织经病理确诊。新鲜标本                             eFluor 506、CD16/CD32 抗体、CD45⁃percp⁃cy5.5 抗
                                                                      TM
              收集后放置于组织保存液中。本研究严格遵照《赫                            体、NK1.1⁃FITC 抗体（eBioscience 公司，美国），凋亡
              尔辛基宣言》进行，并已通过南京医科大学第一附                            试剂盒（同仁化学公司，日本），DNase I（Roche公司，

              属医院伦理委员会审批（伦理审查编号：2025⁃SR⁃                        瑞士），胶原酶Ⅳ（Sigma⁃Aldrich公司，美国）。
              836），所有患者均知情同意。                                   1.1.3 实验动物
              1.1.2 实验材料                                             SPF 级、6 周龄健康 NCG 小鼠和 C57BL/6 小鼠，
                  细胞系：人胃癌细胞系MKN1、AGS购自厦门逸                       购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，所有实
              漠生物科技公司，人 NK92MI 细胞系购自上海富衡                        验动物均饲养于南京医科大学动物实验中心，实验
              生物科技有限公司，C57BL/6 鼠来源的胃癌细胞系                        期间自由进食和饮水。本研究中实验步骤严格遵
              YTN16由日本东京大学Sachiyo Nomura教授赠予。                   守“3R”原则。本研究已通过南京医科大学实验动
                  细胞实验相关试剂：胎牛血清、RPMI⁃1640培养                     物伦理审查（批准编号：2311049）。
              基、DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffe⁃                1.2 方法
              red saline，PBS）、青霉素⁃链霉素溶液（南京森贝伽有                  1.2.1 数据库分析
              限公司），胰蛋白酶⁃EDTA消化液、L⁃谷氨酰胺（赛默                            临 床 数 据 及 微 阵 列 数 据（ACRG 数 据 集 的
              飞世尔科技公司，美国），胶原包被液（STEMCELL公                       GSE66229，包含 100 例正常受试者和 300 例胃癌患
                                +
              司，加拿大），MITO Serum Extender 添加剂、Trans⁃             者的数据）均下载自基因表达综合数据库（gene
              well 小室（Corning 公司，美国），NK92MI 细胞专用培               expression omnibus，GEO）。单细胞 RNA 测序（single⁃
              养基（上海富衡生物科技有限公司），Polybrene、嘌呤                     cell RNA sequencing，scRNA⁃seq）数据下载自 GEO
              霉素（北京索莱宝科技有限公司），细胞裂解液、                            数据库（GSE206785）和国家基因库生命大数据平
              DEPC 水、结晶紫染色液（上海碧云天有限公司），                         台。数据整合、无监督聚类及可视化分析均采用
              CCK⁃8检测试剂盒（同仁化学公司，日本），无血清细                        Seurat框架完成。
              胞冻存液（苏州新赛美生物科技有限公司），Cell⁃                         1.2.2 转录组测序分析
              Light EdU Apollo567 In Vitro Kit（广州锐博生物科技              从 NC 组和 PTPN6⁃OE 组的 AGS 细胞中提取总
              有限公司），jetPRIME试剂盒（PolyPlus公司，法国）。                 mRNA。按照 Illumina 标准流程构建文库并进行双
                  类器官实验相关试剂：人胃癌类器官（gastric                      端 150 bp 测 序 。 原 始 测 序 数 据 通 过 fastp 软 件
              cancer organoid，GCO）培养基（苏州伯桢生物科技                 （v0.24.1）去除接头及低质量序列。高质量序列通过
              有限公司），基质胶（Corning 公司，美国），TryplE 消                 STAR 软 件（v2.7.11）比 对 至 人 类 参 考 基 因 组
              化酶（赛默飞世尔科技公司，美国）。                                （GRCh37），并通过 featureCounts（v2.1.1）进行基因

                  Western blot实验相关试剂：β⁃actin抗体、SHP⁃1            水平统计。使用 R 语言 DESeq2软件包（v1.42.1）对
             （PTPN6）抗 体（Cell Signaling Technology 公 司 ，美        基因读数进行标准化处理及差异表达分析。差异
              国），SDS⁃PAGE 预制胶（南京金斯瑞有限公司），                       表达基因（differentially expressed gene，DEG）的筛选
              PVDF 膜、ECL 化学发光显影液（默克生物有限公                        标 准 为 ：错 误 发 现 率（false discovery rate，FDR）<
              司，美国），一抗稀释液、快速封闭液、RIPA 裂解液                        0.05，且|log2FC|>0.25。

             （上海碧云天有限公司），十二烷基硫酸锂（lithium                        1.2.3 差异基因富集分析
              dodecyl sulfate，LDS）上样缓冲液、蛋白分子质量                       使用clusterProfiler软件对Hallmark基因集进行
              marker（赛默飞世尔科技公司，美国），含吐温⁃20 的                     差异表达基因的 GSEA 通路富集统计，将 P < 0.05
              Tris 盐酸缓冲液（Tris⁃buffered saline with Tween⁃20，    的Hallmark pathway设定为显著的富集结果。
              TBST）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技                        1.2.4 全外显子测序分析
              有限公司）。                                                 从类器官及对应组织中提取 DNA，提取后的
   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37