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第46卷第5期 王心雅，罗 琳，高 乾，等. PTPN6在胃癌中的作用及对NK细胞介导杀伤活性的影响［J］.
2026年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（5）：652-663，690 ·655 ·
DNA通过NanoDrop 2000紫外分光光度计检测其浓 种于 6 孔板中，24 h 后使用 jetPRIME 试剂盒进行细
度和纯度。随后使用 Agilent SureSelect Human All 胞转染，取 2 μg 质粒或者 5 nmol siRNA 与 200 μL
Exon V6 富集外显子序列，并遵循标准流程构建文 jetPRIME buffer 涡旋混匀，再加入 4 μL jetPRIME 试
库，在Illumina测序平台进行双端 150 bp 测序。通 剂，涡旋瞬离后室温静置10 min，更换细胞培养皿中
过 Trimmomatic 软 件（v0.36）对 原 始 数 据 进 行 过 的培养基，将静置后的混合溶液加入培养皿中，轻
滤，去除引物序列、接头序列及低质量序列，使用 柔摇晃，使之混匀。24 h后更换培养基。
BWA⁃MEM（v0.7.15）将高质量读段比对至人类参考 1.2.9 慢病毒感染细胞和类器官
基因组序列（GRCh37）。使用SAMtools 软件将BAM 人 PTPN6 过表达慢病毒和对照慢病毒购于上
文件排序，并使用 Picard 软件（v2.16）标记重复序 海吉凯基因医学科技股份有限公司。MKN1细胞以
列。使用 GATK（v4.1.7）对序列碱基的质量值进行 感染复数（multiplicity of infection，MOI）=10 进行慢
重新校正，并严格遵循推荐流程识别体细胞点突 病毒感染，AGS细胞和YTN16细胞以MOI=20进行慢
变和插入/缺失，并进行质控。通过初步质控的突 病毒感染。当细胞融合率达30%~40%时，更换培养
变纳入后续分析。所有体细胞突变均通过 Funco⁃ 基，加入冰上解冻的慢病毒液和终浓度为5 μg/mL的
tator（v1.6.0）注释突变对应的基因和转录本信息、变 Polybrene，混匀后放入细胞培养箱，24 h后更换培养
异类型等信息。使用TitanCNA（v1.23.1）进行了拷贝 基，继续培养 24~48 h，根据抗性的不同分别加入嘌
数改变分析。使用SigProfiler工具进行突变特征的全 呤霉素和杀稻瘟菌素持续筛选 7 d。胃癌类器官以
基因组提取，并分解为COSMIC（v3）突变特征集。 MOI=100 进行慢病毒感染。使用 TrypLE 吹散类器
1.2.5 细胞培养 官，转移到离心管中，放入 37 ℃细胞培养箱孵育5~
MKN1和AGS细胞使用含10%胎牛血清、1%青 8 min，取出后吹打混匀，离心去上清液，用加入慢病
霉素⁃链霉素的RPMI⁃1640培养基培养，YTN16细胞 毒液和Polybrene的胃癌类器官培养基重悬类器官，
使用含10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素、1%L⁃谷氨 加入48孔板中，放入37 ℃细胞培养箱孵育4~8 h，离
酰胺、0.1%MITO serum extender 的DMEM培养基培 心去上清液，用PBS洗涤1遍后用基质胶重悬沉淀，
+
养，NK92MI 细胞使用 NK92MI 细胞专用培养基培 接种到 48 孔板中，放入培养箱 20 min，基质胶固化
养，并放置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中。 后，每孔加入300 μL胃癌类器官培养基。72 h后根
1.2.6 胃癌类器官培养 据抗性的不同分别加入嘌呤霉素和杀稻瘟菌素持
用无菌手术刀将新鲜采集的胃癌组织解离成 续筛选7 d。
0.3 mm 大小的组织块，加入含胶原酶的DMEM培养 1.2.10 qRT⁃PCR
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基中，置于37 ℃摇床中消化30 min，收集细胞悬液， 使用诺唯赞细胞总 RNA 提取试剂盒进行 RNA
400 g 离心3 min。PBS洗涤后用基质胶重悬细胞沉 提取，检测 RNA 提取浓度和纯度后，使用 5× Prime⁃
淀，并接种于48孔板中，放入培养箱20 min，基质胶固 Script RT Master Mix 逆转录合成试剂盒进行逆转
化后，每孔加入300 μL胃癌类器官培养基。每3~4 d 录，使用 TB Green premix EX Taq 试剂盒进行 qRT⁃
更换1次培养基，并使用TrypLE 酶每1~2周传代1次。 PCR。以β⁃actin为内参基因进行分析。具体各基因
1.2.7 PTPN6的过表达质粒和siRNA的构建 引 物 序 列 如 下 ：β ⁃ actin（F：5′ ⁃ CATGTACGTTGC⁃
PTPN6 过表达质粒（pcDNA3.1⁃PTPN6）由优宝 TATCCAGGC⁃3′；R：5′⁃CTCCTTAATGTCACGCAC⁃
生物公司构建，即将目的基因克隆到 pcDNA3.1⁃ GAT）⁃3′；PTPN6（F：5′⁃GGTGTCCACGGTAGCTTCC⁃
3xFlag⁃C 质粒载体上，经测序鉴定其序列完全正 3′ ；R：5′ ⁃ ACAGGTCATAGAAATCCCCTGAG ⁃ 3′）；
确。由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成2个 HLA⁃A（F：5′⁃GCTCCCACTCCATGAGGTAT⁃3′；R：5′⁃
针对PTPN6基因不同靶点的siRNA序列，分别命名 AGTCTGTGACTGGGCCTTCA ⁃ 3′ ）；HLA ⁃ B（F：5′ ⁃
为 siPTPN6⁃1（5′⁃GCCCAGUUCAUUGAAACCATT⁃ ACTGAGCTTGTGGAGACCAGA⁃3′；R：5′⁃GCAGCC⁃
3′），siPTPN6⁃2（5′⁃GAGCAUGACACAACCGAAUTT⁃ CCTCATGCTGT⁃3′）；HLA⁃C（F：5′⁃CTGGCCCTGA⁃
3′），以及对照 siNC（5′⁃UUCUCCGAACGUGUCAC⁃ CCGAGACCTG⁃3′；R：5′⁃CGCTTGTACTTCTGTGTC⁃
GUTT⁃3′）。 TCC⁃3′）；HLA⁃E（F：5′⁃TTCCGAGTGAATCTGCG⁃
1.2.8 细胞转染 GAC⁃3′；R：5′⁃GTCGTAGGCGAACTGTTCATAC⁃3′）；
取对数生长期的细胞，以 2×10 个/孔的密度接 MICA（F：5′⁃AGGGTTTCTTGCTGAGGTACA⁃3′；R：5′⁃
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