Page 34 - 南京医科大学自然版
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第46卷第5期
              ·656 ·                             南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年5月


              GGTCTCTCTGTCCCATGTCTTA ⁃ 3′）；MICB（F：5′ ⁃          基质胶与 PBS 按 1∶30 的比例进行稀释，取 50 μL 铺
              TGGAGACTCAAGAATCGACAGT⁃3′；R：5′⁃CTGCA⁃             于小室上，放入培养箱 1 h，后续细胞及培养步骤与
              TAGCGCGATAGTGTG⁃3′）；PD⁃L1（F：5′⁃GGACAA⁃            迁移实验相同。
              GCAGTGACCATCAAG⁃3′；R：5′⁃CCCAGAATTACC⁃             1.2.15 克隆形成实验
              AAGTGAGTCCT⁃3′）；TGFB（F：5′⁃CTAATGGTGGA⁃                 以1 000个/孔的密度均匀地将MKN1和AGS细
              AACCCACAACG⁃3′；R：5′⁃TATCGCCAGGAATTGTT⁃            胞分别接种于6孔细胞板中，放入培养箱继续培养，
              GCTG⁃3′）；CD155（F：5′⁃GGACGGCAAGAATGTGA⁃            每3 d更换1次培养基，培养12 d后，弃掉上清液，加
              CCT⁃3′；R：5′⁃GGTCGTGCTCCAATTATAGCCT⁃3′）。           入甲醇固定30 min，吸去甲醇，加入800 μL结晶紫染

              1.2.11 Western blot                               色30 min，弃掉结晶紫，用超纯水洗涤2次。于倒置
                  收集细胞样品，RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA                      显微镜下对每个孔拍照，使用Image J软件计数。
              试剂盒检测蛋白浓度，将细胞裂解物煮沸，SDS聚丙                          1.2.16 EdU增殖实验
              烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，再用                               将 MKN1 和 AGS 细胞以 1×10 个/孔铺板在 96
                                                                                               4
              5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，                        孔板中，24 h 后，使用 Cell⁃Light EdU Apollo567 In
              用1×TBST洗涤3次，再加入HRP标记抗兔或抗小鼠                        Vitro Kit 试剂盒对细胞进行处理，在荧光显微镜下

              二抗，室温孵育2 h，使用1×TBST洗涤3次，孵育ECL                     进行拍摄，每孔分别用紫外激发光（代表总细胞数）
              发光液，通过化学成像仪检测目标蛋白表达情况。                            和绿色激发光（代表孵育2 h内新增殖的细胞数）拍
              1.2.12 NK细胞杀伤活性检测实验                               摄5张。以2 h内新增殖的细胞数/总细胞数代表该
                  肿瘤细胞计数铺板，贴壁后换液，按照效靶比                          组细胞的增殖率。
              2∶1 加入 NK92MI 细胞，共培养 4 h 后，收集样本，使                 1.2.17 流式细胞术
              用CD45抗体染色标记NK92MI细胞，然后使用凋亡                             无菌条件下切碎小鼠肿瘤组织，配制消化液
              试剂盒标记凋亡细胞，最后使用流式细胞仪上机检                           （10 mL HBSS，1 mL 灭活 FBS，5 μL 胶原酶Ⅳ，5 μL
              测。对于胃癌类器官和 NK 细胞共培养，先将基质                          DNase 酶），加入消化液并置于 37 ℃摇床中消化
              胶平铺在孔板底部，凝固后再加入胃癌类器官，24 h                         20 min，将消化好的组织过70 μm细胞筛，得到单细
              后换液并加入 NK92MI 细胞。NK 细胞介导的细胞                       胞悬液。使用 FACS 缓冲液（含 2%灭活 FBS 和 1%
              素性=［（实验组凋亡肿瘤细胞数/实验给全部肿瘤细                          EDTA的PBS）洗涤细胞后，首先使用Fixable Viability
              胞数）×100%］-［（空白对照组凋亡肿瘤细胞数/空白                       Dye eFluor 506 在避光条件下染 10 min，以区分死
                                                                          TM
              对照组全部肿瘤细胞数）×100%］。                                细胞。洗涤后，使用封闭染料CD16/CD32抗体进行
              1.2.13 CCK⁃8实验                                    Fc受体封闭10 min。洗涤后使用CD45⁃percp⁃cy5.5、
                  将MKN1和AGS细胞以3 000个/孔铺板在96孔                    NK1.1⁃FITC 抗体于避光条件下进行细胞表面染色
              板中，共接种5块96孔板，每隔24 h，取出1块96孔板                      30 min。染色完成后，使用 FACS 缓冲液洗涤细胞。
              每孔替换100 μL含10%CCK⁃8试剂的RPMI⁃1640培                  最后使用流式细胞仪上机检测。所有流式细胞数
              养基，放置培养箱中，孵育2 h，用酶标仪测定450 nm                      据均通过FlowJo（v10.8.1）软件进行分析。
              的吸光度。连续检测 5 d。以仅含培养液和 CCK⁃8                       1.2.18 小鼠体内荷瘤实验
              试剂（不含细胞）的孔作为空白对照。标化后的细                                 取生长状态良好的YTN16细胞消化计数后，用
              胞增殖指数=（ODDayx-OD 空白）/（ODDay0-OD 空白）。              PBS 和基质胶 1∶1 混合物重悬细胞，浓度调整为 5×
              1.2.14 Transwell迁移和侵袭实验                           10 个/200 μL，使用 1 mL 注射器将细胞悬液分别打
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                  对于细胞迁移实验，将MKN1和AGS细胞以1×                       入 NCG 鼠和 C57BL/6 鼠两侧腋窝处皮下，每只小鼠
              10 个/孔接种于 Transwell 小室（含 100 μL 无血清培              接种200 μL。自接种日起，每天观察小鼠状态和肿
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              养基），24 孔板下室加入 600 μL 含 10%FBS 的培养                 瘤生长状态。
              基，放置培养箱中，24 h后，弃掉上清液，加入甲醇固                        1.3  统计学方法
              定30 min，吸去甲醇，加入800 μL结晶紫染色30 min，                      实验数据采用 GraphPad Prism 10 软件进行分
              吸取结晶紫，用超纯水洗涤 2 次。移除上室未迁移                          析。定量数据表示为均数±标准差（x ± s），两组间比
              细胞，于倒置显微镜下随机选取3个视野拍照，使用                           较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。
              Image J软件计数。对于细胞侵袭实验，在接种前将                        对于连续性变量间的相关性，采用Spearman秩相关
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