Page 44 - 南京医科大学自然版
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第46卷第5期
              ·666 ·                             南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年5月


              号：IACUC⁃2408032）。                                 内，待细胞融合至 40%时，将室温孵育 5 min 后的
              1.2.2 肾功能指标检测                                     Lipofectamine 2000 分别与 tRF⁃AsnGTT⁃33 mimic、
                  检测Scr：取96孔板，各样本取6 μL加入孔内，标                    tRF⁃AsnGTT⁃33 NC mimic混匀（转染浓度：50 nmol/L），
              准孔及空白孔分别加入标准品6μL、蒸馏水6 μL，向                        缓慢加入无血清培养基内，每孔加入 2 mL，37 ℃、
              各孔分别加入酶溶液 A 180 μL，37 ℃孵育 5 min，                  5% CO2的孵箱内孵育4~6 h后更换为正常含血清培
              546 nm波长测定吸光度值，计为A1，向各孔内加入酶                       养基，转染完成 24 h 后加入 ADR 干预 24 h（干预浓
              溶液B 60 μL，546 nm波长测定吸光度值，计为A2，计                   度为1 μg/mL），依据转染条件不同分为4组：Control

              算ΔA=A2-K×A1，K为稀释因子，数值为31/41，则Scr                  组、ADR组、ADR+tRF NC组、ADR+tRF mimic组。
                                                                1.2.6 CCK⁃8检测细胞存活率
              结果为（ΔA 测定-ΔA 空白）×C 标准/（ΔA 标准-ΔA 空白），其中C 标准
              为标准品浓度，为442 μmol/L。                                    足细胞分化完成后以 5×10 个/mL 密度接种于
                                                                                             3
                  检测BUN：取96孔板，待测定样本取4 μL加入                      96孔板内，每组6个复孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱内
              孔内，标准孔及空白孔分别加入 10 mmol/L BUN 标                    继续培养至细胞完成贴壁，每孔 PBS 洗 2 遍后根据
              准品 4 μl、蒸馏水 4 μL，每孔再加入 50 μL 缓冲酶                  ADR浓度分为0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL共5组，分组
              液，混匀后 37 ℃孵育 10 min，依次向各孔加入酚显                     进行干预，每孔加入 10% CCK⁃8 溶液，放回孵箱内
              色液及碱性次氯酸钠各 200 μL，混匀后 37 ℃孵育                      继续培养3 h，酶标仪检测各孔在450 nm处吸光度。
              10 min，酶标仪测定 546 nm 处吸光度，则 BUN 结果                 1.2.7 Real⁃time qPCR
              为（ΔA 测定-ΔA 空白）×C 标准/（ΔA 标准-ΔA 空白），其中C 标准为              取小鼠肾脏组织每只约 20 mg，每管加入 1 mL
              标准品浓度，为10 μmol/L。                                 Trizol试剂后置于研磨机内充分研磨，通风橱内向各
              1.2.3  苏 木 精 和 伊 红 染 色（hematoxylin and eosin      管加入 200 μL 氯仿，振荡 30 s，冰上静置 15 min，
              staining，HE）和过典酸⁃雪芙染色（periodic acid⁃schiff        4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，小心吸取上清液，加
              stain，PAS）                                        入等体积异丙醇摇晃混匀，冰上静置10 min后4 ℃、
                  HE染色：用切片机将蜡块切成厚度为3~5 μm薄                      12 000 r/min离心15 min，弃上清液，每管加入500 μL
              片后80 ℃烘箱烤30 min，再贴附于载玻片上；将载玻                      75%乙醇，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，擦干
              片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5~10 min完成                        管内液体，向管底加入 20 μL DEPC 水，小心吹打混
              脱蜡，再依次经过100%、95%、90%、80%、70%酒精各                   匀即得到总 RNA。细胞经 Trizol 充分裂解完成后，
              2~3 min，最后用蒸馏水冲洗，苏木精染色10 min，清                    经氯仿萃取、异丙醇沉淀、75%乙醇漂洗等步骤提取
              水冲洗，1%盐酸酒精分化20 s，清水冲洗3次，伊红染                       细胞总 RNA。分光光度计测出总 RNA 浓度及纯
              色2 min，封片。                                        度，依据反转录试剂盒操作说明书进行反转录，得
                  PAS 染色：石蜡切片脱蜡复水后放入过碘酸溶                        到 cDNA，各样本均设置 3 个复孔，RT⁃qPCR 法检测
              液中氧化 7 min，蒸馏水冲洗 3 次，雪夫试剂染色                       各样本tRF⁃AsnGTT⁃33及足细胞标志蛋白mRNA的
              20 min，蒸馏水冲洗，苏木精染色 2 min，清水冲洗，                    ct 值（tRF⁃AsnGTT⁃33 引物序列：5′⁃CTGTTAACC⁃
              梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。                                  GAAAGGTTGGTG⁃3′），U6 作为内参，用 2          -ΔΔCT  法计
              1.2.4 细胞培养                                        算 tRF⁃AsnGTT⁃33 相对表达量，β⁃actin 为内参，用
                  永生化小鼠肾小球足细胞（MPC5细胞系）来源                        2 - ΔΔCT  法计算足细胞标志蛋白 mRNA 相对表达量。
              于南京医科大学第二附属医院肾脏病研究中心。将                            U6和tRF⁃AsnGTT⁃33引物均由广州锐博生物设计合
              足细胞培养在含0.1%IFN⁃γ、10%胎牛血清和1%青霉                     成，其余引物由上海锐真生物公司合成，序列如表1。
              素⁃链霉素的 RPMI 1640 完全培养基中，置于 33 ℃、                  1.2.8 Western blot
              5% CO2孵箱中隔天换液，细胞融合至 80%~90%用                           取小鼠肾脏组织加入 RIPA 及 PMSF，充分研磨

              胰酶消化传代。足细胞培养于不含 IFN⁃γ的 RPMI                       后离心（4 ℃、12 000 r/min）30 min，BCA 法测定上清
              1640 完全培养基中，置于 37 ℃、5% CO2孵箱中诱导                   液蛋白浓度，用 SDS⁃PAGE 上样缓冲液制备上样蛋
              分化7~14 d。待细胞融合至70%时进行分组干预。                        白，沸水浴5 min后-80 ℃保存备用。提取细胞蛋白时
              1.2.5 tRF⁃AsnGTT⁃33过表达转染                          在加入RIPA裂解液及PMSF后冰上静置40 min，刮取
                  足细胞处于对数生长期时按照 2 ×10 个/mL 密                    细胞后离心（4°C、12 000 r/min）15 min，余步骤与提
                                                    5
              度将其接种至 6 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2的孵箱                    取组织蛋白相同。每孔蛋白上样量 10 μg，经 SDS⁃
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