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第46卷第9期     魏甲园，徐聖业，朱妍妍，等. ReN细胞来源纳米囊泡中的let⁃7i⁃5p在帕金森病模型中通过抗凋亡作用
                  2026年9月             发挥保护效应［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（9）：1303-1314                   ·1305 ·


                                                                                                          4
                                                                      ReN细胞分化：将消化后的细胞以3×10 个/cm                 2
                1 材料和方法
                                                                  的密度接种于24孔板内的盖玻片上，在生长培养基
                1.1  材料                                           中培养3~4 d直至细胞融合。随后将培养基更换为
                    实验动物均为南京医科大学医药实验动物中                           不含生长因子的培养基，诱导细胞分化。
                心提供的野生型 C57BL/6 小鼠，饲养在 SPF 级动物                    1.2.2  NV制备和鉴定
                房；人神经母细胞瘤细胞SH⁃SY5Y由南京大学模式                             首先使用 Accutase 分离收集后的 ReN 细胞球，
                动物研究所石云教授赠予；ReN 细胞和 PVDF 膜购                       超声裂解得到细胞匀浆，300 g 离心 10 min，1 200 g
                于美国 Millipore 公司；tdTomato 标记的外泌体由美                离心 20 min，再用 10 000 g 离心 30 min，去除细胞和
                国马萨诸塞州综合医院 Dr Bakhos Tannous 提供；                  碎片。所得上清依次通过 1 μm、400 nm、200 nm 的

                B 细胞淋巴瘤（B⁃cell lymphoma，Bcl）⁃2 抗体、Bcl⁃2           聚碳酸酯多孔膜进行挤压过滤，再采用160 000 g超
                相关 X 蛋白（Bcl⁃2 associated X protein，Bax）抗体、        离心 120 min 分离 NV，并在 PBS 中以相同的超离心
                β⁃actin 抗体、α⁃微管蛋白（α⁃tubulin）抗体及热休克                条件进行洗涤，最后将NV重悬于PBS中，通过BCA
                蛋白 70（heat shock protein 70，HSP70）抗体（南京巴          法测定总蛋白质浓度。将得到的NV采用纳米颗粒
                傲得生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、DAPI、酪                       跟踪分析系统（nanoparticles tracking analysis system，

                氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体、1⁃甲基⁃            NTA）（Particle Metrix GmbH 公司，德国）对 NV 的粒
                4⁃苯基⁃1，2，3，6⁃四氢吡啶（1⁃methyl⁃4⁃phenyl⁃1，2，          径和浓度进行定量分析 。
                                                                                       ［22］
                3，6⁃tetrahydro⁃pyridine，MPTP）和 1⁃甲基⁃4⁃苯基吡         1.2.3 PD模型建立和分组处理
                啶阳离子（1⁃methyl⁃4⁃phenylpyridinium ion，MPP ）            动物模型：选用 8~10 周龄的 C57BL/6 小鼠，通
                                                            +
               （Sigma 公司，美国）；细胞消化液 Accutase、胎牛血                   过腹腔注射20 mg/kg MPTP，连续给药5 d，构建急性
                清、B⁃27、谷氨酰胺和青霉素链霉素双抗（Thermo                       PD小鼠模型。
                Fisher 公司，美国）；DMEM/F12 培养基（南京凯基生                      分组处理：适应性喂养1~2周后，随机分为4 组
                物技术股份有限公司）；碱性成纤维细胞生长因子                           （n=3）。①Control 组：造模阶段腹腔注射 20 mg/kg
                2（basic fibroblast growth factor 2，bFGF2）和表皮生长    PBS；治疗阶段于 1、3、5、7、9 d 尾静脉注射 100 μL
                因子（epidermal growth factor，EGF）（PeproTech公司，      PBS。②MPTP+PBS 组：腹腔注射 20 mg/kg MPTP 造
                美国）；小胶质细胞 BV2、let⁃7i⁃5p 模拟物（let⁃7i⁃               模；治疗阶段于 1、3、5、7、9 d 尾静脉注射 100 μL
                5p mimic）、小胶质细胞标志物 Iba1 抗体和半胱氨                    PBS。③MPTP+ReN⁃NV 组（MPTP+RV 组）：腹腔注
                酸天冬氨酸蛋白酶⁃3（cysteine⁃dependent aspartate⁃          射20 mg/kg MPTP 造模；治疗阶段于1、3、5、7、9 d尾
                specific protease⁃3，Caspase⁃3）抗体（上海吉玛制药           静脉注射溶于 100 μL PBS 中的 100 μg 未经修饰
                技术有限公司）。0.2、0.4、1.0 μm 聚碳酸酯多孔膜                    的 ReN⁃NV。④MPTP+RVG⁃ReN⁃NV 组（MPTP+
                和支持膜（Whatman 公司，英国）；CCK⁃8 测定试剂                    RVG⁃RV 组）：腹腔注射 20 mg/kg MPTP 造模；治疗
                盒、RIPA 裂解液、反转录试剂盒和荧光定量检测试                         阶段于1、3、5、7、9 d尾静脉注射溶于100 μL PBS中
                剂盒均（上海碧云天生物技术有限公司）；BCA蛋白                          的 100 μg RVG⁃ReN⁃NV。15 d 后进行心脏灌流，收
                质定量试剂盒（Pierce公司，美国）。                              集血清及保存脑备用。动物实验已获得南京医科大
                1.2  方法                                           学实验动物伦理委员会批准（编号：IACUC⁃1601153、
                1.2.1  ReN细胞培养和分化                                 IACUC⁃2303006）。
                    ReN 细胞培养于 DMEM/F12 高糖培养基中，该                   1.2.4  转棒实验
                培养基添加了 2% B⁃27、谷氨酰胺、1%青霉素⁃链霉                          建模前 3 d 开始对小鼠进行适应性训练，每天
                素、20 μg/mL EGF和20 μg/mL bFGF2。所有细胞均               训练3次，每次10 min，使小鼠熟悉实验环境及转棒
                置于 37 ℃、5%CO2条件下的培养箱中培养                ［22］ 。待    操作流程。建模完成后第1天进行正式测试。实验
                ReN 细胞在上述培养基中生长形成单个神经球，转                          时将小鼠置于转棒仪上，转棒初始速度设为4 r/min，
                移至未包被的培养皿（60 mm×15 mm）中继续培养，                      并逐渐加速至 30 r/min，加速度为 20 r/min，总测试
                在培养基成分不变的情况下培养 3~4 d 后，收集细                        时间为 300 s。记录小鼠自转棒上掉落的总时间。
                胞球用于 NV 分离，本研究中培养的 ReN 细胞分泌                       每只小鼠连续测试 3 次，每次测试间隔 30 min。最
                的所有NV均分离自传代15~30代的细胞。                             终取3次测试结果的平均值作为该小鼠的转棒实验
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