Page 36 - 南京医科大学自然版
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第46卷第9期
               ·1306 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年9月


              结果。                                               体，1∶2 000；Caspase⁃3 抗体，1∶1 000；HSP70 抗体，
              1.2.5  爬杆实验                                       1∶1 000）中4 ℃孵育过夜。次日用含有0.1 % Tween⁃
                  建模前 3 d 开始对小鼠进行适应性训练，每天                       20 的 TBS（TBST）清洗膜 3 次，每次 5 min，用二抗
              训练3次，每次10 min，使其熟悉爬杆操作。实验装                       （HRP 标记的山羊抗兔，1∶10 000）室温下孵育条带
              置为 1 根长 60 cm、半径 0.5 cm 的垂直钢杆，钢杆顶                 1 h，用 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min。带有蛋白的条
              端设有半径 1.2 cm 的球形突起。正式测试时，将小                       带在显影液 ECL high⁃sig Western blotting substrate
              鼠头部朝上置于球形突起顶部，记录其自钢杆顶端                            浸染，利用 ECL Plus detection systems 显影，并使用
              爬至底端着地所需的总时间。每只小鼠测试 3 次，                          Image J软件分析。
              每次测试间隔 30 min，取 3 次结果的平均值作为最                           细胞样品：将收取的转染 NC/let⁃7i⁃5p mimic 经
              终爬杆总时间。                                           过不同处理（PBS 或MPP ）的SH⁃SY5Y 细胞，用PBS
                                                                                      +
              1.2.6  免疫荧光染色                                     清洗两遍，加入适量的全细胞裂解液（加入蛋白酶
                  为研究NV在小鼠脑组织中的定位及其与不同                          抑制剂）在冰上裂解 30 min 后，转移至 1.5 mL EP 管
              细胞类型的关系，通过尾静脉注射由 tdTomato 标记                      中，4 ℃离心，12 000 r/min，15 min。取上清，用 BCA
              的NV或RVG⁃NV。麻醉小鼠，用预冷的PBS以及用                        方法进行蛋白质浓度测定。剩余步骤与上述一致。
              PBS 配制的 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA，             1.2.8  细胞建模和分组
              pH 7.4）心脏灌流。灌流后取脑组织在4% PFA中浸                           将 SH⁃SY5Y 细胞培养于含 10%胎牛血清的
              泡过夜，在30%蔗糖溶液中脱水48 h，待脑组织沉底                        DMEM 高糖培养基中，置于 37 ℃、5% CO2 的培养
              后用OCT 包埋，冰冻切片机上制备厚度25 μm 的冰                       箱内。为了建立 PD 的体外细胞模型，使用不同浓
              冻组织切片，-80 ℃冰箱保存备用。将脑组织冰冻                          度（0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L）的 MPP 处理 SH⁃
                                                                                                     +
              切片置于含有 0.5% Triton X⁃100 的 PBS 中，摇床上              SY5Y细胞24 h。
              放 置 30 min，随 后 在 0.1% Triton X ⁃ 100 的 PBS             为明确 ReN⁃NV 在体外的直接神经保护作
             （PBST）配制的3% BSA中封闭2 h，加入一抗（TH抗                     用，将 SH⁃SY5Y 细胞随机分为 3 组：Control 组，细
                                                                                                      +
              体，1∶500；Iba1 抗体，1∶1 000）4 ℃孵育过夜。PBST              胞正常培养，不给予任何特殊处理；MPP 组，给予
              清洗 3 次，每次 5 min，样品加二抗（山羊抗兔二抗，                     1 mmol/L MPP 处理 24 h 构建损伤模型；MPP +RV
                                                                             +
                                                                                                          +
                                                                                      +
              1∶500；山羊抗鼠二抗，1∶2 000）在室温下孵育 1 h                   组，在给予1 mmol/L MPP 处理的同时，加入10 μg/mL
              后，PBST 清洗 3 次，每次 10 min，最后用 DAPI 染色               ReN⁃NV共同孵育24 h。
              5 min。PBS 清洗 3 次，每次 5 min，甘油封片。共聚                      为明确 let⁃7i⁃5p 的抗凋亡作用，将 SH⁃SY5Y 细
              焦显微镜下拍摄，并用Image J进行分析。                            胞随机分为 4 组：NC 组、Mimic 组、NC+MPP 组、
                                                                                                          +
                                                                           +
              1.2.7  蛋白质免疫印迹实验（Western blot）                    Mimic+MPP 组。待 SH⁃SY5Y 细胞融合至 40%时，
                  组织样品：在对不同组（Control 组、MPTP+PBS                 将室温孵育 5 min 后的 Lipofectamine 2000 分别与
              组、MPTP+RV 组和 MPTP+RVG⁃RV 组）小鼠处理满                  let⁃7i⁃5p NC mimic、let⁃7i⁃5p mimic 混匀（转染浓度：
              15 d后，将小鼠麻醉再快速断头取脑，对脑解剖取纹状                        50 nmol/L），缓慢加入无血清培养基内，每孔加入2 mL，
              体组织加入RIPA裂解液，充分裂解后以12 000 r/min                   37 ℃、5% CO2的孵箱内孵育 4~6 h 后更换为正常含
              4 ℃离心 15 min，取上清用 BCA 方法进行蛋白质浓                    血清培养基，转染完成24 h后加入1 mmol/L MPP 干
                                                                                                            +
              度测定。将每份样品等量蛋白原液用上样缓冲液                             预24 h。
              制备蛋白样品，95 ℃煮 10 min，使其变性。在配制                           BV2 细胞采用 DMEM 培养基培养，培养基中含
              好的聚丙烯酰胺凝胶中上样 5~20 μg，采用 80 V 电                    10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素（100 U/mL）双抗
              压，使得蛋白样品在浓缩胶中浓缩，待样品跑至分                            溶液。细胞置于 37 °C、5% CO2的培养箱中恒温培
              离胶后，将电压调至 120 V，持续电泳，直至样品跑                        养，待生长汇合至70%~80%传代、接种细胞。
              至凝胶底部。电泳结束后，将蛋白转移至 PVDF 膜                              为明确let⁃7i⁃5p的抗炎症作用，将BV2细胞随机
              上，排去气泡后，0.3 A 恒流转膜 1 h。将 PVDF 膜在                  分为4组：NC 组、Mimic组、NC+MPP 组、Mimic+MPP           +
                                                                                                +
              脱脂奶粉溶液中封闭1 h后，按照分子量裁开，分别                          组。待细胞融合至 40%时，将室温孵育 5 min 后的
              在一抗（TH 抗体，1∶2 000；β⁃actin 抗体，1∶1 000；             Lipofectamine 2000分别与let⁃7i⁃5p NC mimic、let⁃7i⁃
              Bcl⁃2 抗体，1∶1 000；Bax 抗体，1∶1 000；α⁃tubulin 抗       5p mimic 混匀（转染浓度：50 nmol/L），缓慢加入无
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