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第46卷第9期     魏甲园，徐聖业，朱妍妍，等. ReN细胞来源纳米囊泡中的let⁃7i⁃5p在帕金森病模型中通过抗凋亡作用
                  2026年9月             发挥保护效应［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（9）：1303-1314                   ·1307 ·


                血清培养基内，每孔加入2 mL，37 ℃、5% CO2的培养                    1.3  统计学方法
                箱内孵育 4~6 h 后更换为正常含血清培养基，转染                            使用 GraphPad Prism 10.1.2 软件对实验数据进
                完成24 h后加入1 mmol/L MPP 干预24 h。                     行统计分析，数据用均值±标准差（x ± s）表示。两组
                                           +
                1.2.9  CCK⁃8 及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，        间数据比较应用 Student’s t 检验，多组间数据比较
                LDH）法检测细胞活力                                       用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）或双因素方差
                    CCK⁃8法检测细胞活力：在96孔板中每孔接种                       分析（two⁃way ANOVA），并用Tukey法进行事后组间
                100 μL SH⁃SY5Y细胞悬液，细胞密度为10%~30%，                  两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
                待贴壁后转染不同质粒，随后加1 mmol/L的MPP 处
                                                           +
                                                                  2 结    果
                理 24 h。在避光条件下每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶
                液，小心摇匀后将其放置于细胞培养箱中30 min，在                        2.1  ReN⁃NV及RVG⁃ReN⁃NV的物理特性鉴定
                450 nm波长下用紫外分光光度仪测定吸光值。                               为明确ReN⁃NV及RVG⁃ReN⁃NV的基本物理特
                    LDH 释放检测：将细胞以 5×10 个/mL 种植于                   性，进行了形态学与粒径表征。通过透射电子显微
                                                 5
                96 孔板中，每个孔板中加入 100 μL 培养液，在                       镜观察，两种囊泡均呈现典型的杯状或球形膜结
                37 ℃、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养 30 min 后，                  构，符合细胞外囊泡的形态学特征。进一步通过NTA
                按照试剂盒说明书收集各组的上清液 80 μL，每孔                         测定其粒径分布，结果显示，ReN⁃NV和RVG⁃ReN⁃NV
                加入 40 μL Working Solution，室温避光孵育 30 min。          的粒径峰值均集中在100~200 nm（图1A、B）。这些
                在490 nm波长处检测其吸光值，计算细胞内LDH释                        数据表明，通过细胞挤压法成功制备了具有标准物
                放量。                                               理特性的 NV。经 RVG 肽修饰后，纳米颗粒表面电
                1.2.10 实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time quan⁃               荷负性显著增强（图 1C），说明 RVG 的引入使颗粒
                titative polymerase chain reaction，RT⁃qPCR）       表面带电性增强，表面结构发生了明显改变，提示
                    为评估 let⁃7i⁃5p 对小胶质细胞激活状态的影                    RVG 成功修饰在载体表面。为评估其体内分布特
                响，采用RT⁃qPCR检测BV2细胞中炎症因子白细胞                        性，通过荧光成像观察了不同处理组样品在小鼠主
                介素（interleukin，IL）⁃6 和 IL⁃1β的 mRNA 表达水            要器官中的分布情况。结果显示，与 PBS 组及未修
                平。各组细胞分别转染 NC 或 let⁃7i⁃5p mimic，转                 饰的 ReN⁃NV 组相比，RVG⁃ReN⁃NV 组在小鼠脑组
                                  +               +          +    织中表现出显著的荧光信号积累，而前两组在脑区
                染 12 h 后，NC+MPP 组和 Mimic+MPP 组加入 MPP
               （1 mmol/L）继续处理24 h，以模拟PD相关炎症微环                     域几乎未检测到明显信号（图1D）。该现象表明，经
                境，NC 组和 Mimic 组则加入 PBS 作为对照。使用                    RVG肽修饰后，NV穿过血脑屏障的能力显著增强，
                TRIzol 试剂提取总 RNA，并通过分光光度计检测                       并能够特异性富集于脑组织。尽管所有组别在肝、
                RNA 的浓度和纯度。按照试剂盒说明书将总 RNA                         肺等器官中均观察到一定程度的非特异性分布，但
                逆转录为 cDNA，随后采用 SYBR Green 法在实时荧                   RVG⁃ReN⁃NV在脑部的相对信号强度显著高于其他
                光定量PCR仪上进行扩增反应。以GAPDH作为内                          组别，证明其具有优异的脑靶向递送效率。
                参，基因的相对表达水平采用 2             -ΔΔCt 方法进行计算。         2.2  RVG⁃ReN⁃NV 可有效改善 MPTP 诱导的 PD 小
                引物由上海吉玛生物公司合成，序列见表1。                              鼠黑质区域多巴胺能神经元损伤
                                                                      对 C57BL/6 小鼠连续 5 d 腹腔注射 20 mg/kg
                                 表1   引物序列
                            Table 1  Primer sequences             MPTP 以进行 PD 小鼠急性造模，并于 1、3、5、7、9 d
                                                                  尾静脉注射 PBS、ReN⁃NV 或者 RVG⁃ReN⁃NV，15 d
                     Gene            Primer sequence（5′→3′）
                                                                  后进行心脏灌流，然后取脑组织进行免疫荧光实验，
                 let⁃7i⁃5p mimic  F：UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU
                                                                  检测小鼠黑质区域 TH 和 Iba1 的表达情况（图 2A）。
                                R：CAGCACAAACUACUACCUCAUU
                                                                  MPTP连续腹腔注射5 d后，小鼠表现出明显的帕金
                 IL⁃1β          F：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT
                                                                  森样运动障碍。转棒实验结果显示，MPTP 组小鼠
                                R：ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
                 IL⁃6           F：TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC         掉落潜伏期较对照组显著缩短（图2B）；爬杆实验结
                                R：TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC           果显示，MPTP组小鼠总下杆时间明显延长（图2C），
                 GAPDH          F：AAGAGGGATGCTGCCCTTAC            提示模型小鼠存在运动协调能力下降及运动迟缓，
                                R：TACGGCCAAATCCGTTCACA            说明 PD 模型构建成功。免疫荧光结果显示，在小
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